[发明专利]一株铜绿假单胞菌及其分离方法和应用

说明书

技术领域

本发明属于环境技术领域，具体涉及一株铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa），其在厌氧条件下具有高效腐殖质还原和多环芳烃降解活性。

背景技术

多环芳烃（Polycyclic aromatic hydrocarbons，PAHs）是指具有两个或两个以上苯环的一类有机化合物，包括萘、蒽、菲、芘等 150余种化合物，有很强的致畸、致癌、致突变作用，具有水溶性差、稳定性强、毒性大、降解困难等特点，是广泛存在于环境中的一类持久性有机污染物。土壤作为环境中多环芳烃的主要归宿地和重要中转站, 通过各种物理化学作用不断将多环芳烃化合物向周围环境释放。目前，多环芳烃污染土壤常规修复方法为物理化学方法，如光氧化法和化学氧化法，但都存在降解率低、耗时长、投资大、应用性差的缺陷。

微生物修复是PAHs污染土壤修复的重要途径，具有成本低、效率高、不易造成二次污染等优点。现有研究结果表明，一些好氧微生物能够通过不同代谢机制将其降解、矿化，为生物修复PAHs污染土壤提供了可能。然而，土壤条件下PAHs污染的环境一般是无氧或者缺氧的，基于好氧微生物的原位生物修复技术具有明显的缺陷。因此厌氧原位生物修复技术成为PAHs污染土壤修复的重要途径。目前已有关于硫酸盐还原菌(Rothermich et al. 2002)和硝酸盐还原菌(Coates et al. 2001)在厌氧条件下降解PAHs的报道。

腐殖质呼吸是近年来倍受关注的新型微生物能量代谢方式，它是指微生物以腐殖质为末端电子受体，通过氧化电子供体偶联腐殖质还原，并从这一过程中贮存生命活动的能量。腐殖质呼吸不仅与碳、氮、磷等元素的自然循环过程相偶联，而且显著影响有机污染物的厌氧降解行为。已有研究结果表明，腐殖质还原菌在污染物（如有机氯代物）厌氧降解体系中发挥着重要作用。经文献和专利检索，尚未发现关于厌氧条件下以腐殖质为电子受体，降解PAHs的铜绿假单胞菌的报道。

发明内容

本发明的目的是弥补现有技术的不足，提供一种厌氧条件下进行腐殖质还原及多环芳烃降解的高效菌株——铜绿假单胞菌菌株。

本发明的另一个目的是提供所述铜绿假单胞菌的分离纯化方法。

本发明还有一个目的是提供所述铜绿假单胞菌的在厌氧降解腐殖质和多环芳烃中应用。

本发明所得的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAH-1，于2011年4月21日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为：CGMCC No. 4773。

本发明所述的铜绿假单胞菌PAH-1具有如下形态和生理生化特性：

1）菌体形态特性

菌株PAH-1呈革兰氏阴性，直杆状（长1.0～2.0μm，宽0.3～0.5μm），具有运动性。

2）菌落形态特性

在有氧LB琼脂平板培养48h后，菌落湿润，光滑，呈淡黄色，不透明，边缘整齐，并分泌绿色或者深褐色的称为绿脓素的色素，菌落直径2-3mm。

3）生理生化特征

非发酵，兼性厌氧。可在41℃生长，在4℃不生长。

3）分子生物学特征

采用SDS-蛋白酶K，氯仿-异戊醇（体积比24：1）抽提，0.6体积异丙醇沉淀的方法提取细菌总DNA。采用细菌16SrRNA通用引物F27和R1492扩增细菌的16SrRNA，将PCR扩增产物回收后进行测序。再将得到的碱基序列在GenBank等国际核酸序列数据库内进行同源序列搜索(Blast search)，找出该菌株与数据库中同源性最高的模式菌株或保藏于ATCC或DSM等国际菌种保藏中心的菌株。根据比对结果，该菌株与铜绿假单胞菌的16SrRNA序列具最高同源性。

结合上述的生理生化特性、16S rDNA序列比对结果，本发明菌株应归属于铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

本发明同时提供了所述铜绿假单胞菌的分离纯化方法：通过微生物燃料电池的阳极生物膜进行分离纯化得到的。

具体分离纯化方法包括以下步骤：

1)  取微生物燃料电池的阳极生物膜接种于液体分离培养基中；

2)  排除已接种液体分离培养基中的氧气，厌氧培养，观察培养液的颜色变化情况；

3)  当培养液颜色从无色变橙黄色时，将培养液转接至另一新鲜的液体分离培养基，继续厌氧富集培养3次；