[发明专利]一种脂肪酶基因及其重组酶和在制备光学活性扁桃酸中的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种脂肪酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，还包括该重组酶的制备方法和其重组脂肪酶转化体作为催化剂以2-乙酰氧基苯乙酸(α-acetoxyphenylacetic acid)及邻氯乙酰氧基苯乙酸(2-Cl-α-acetoxyphenylacetic acid)为底物不对称去酰基化以制备光学活性物质中的应用。

背景技术

扁桃酸(Mandelic Acid，MA)即2-羟基苯乙酸，是一种重要的医药和化工合成中间体，在生物和化学合成中有着广泛的应用。光学纯扁桃酸因其具有良好的生物活性和独特的生理功能，成为备受青睐的药物中间体和酸性手性拆分剂。(S)-扁桃酸是合成用于治疗尿急、尿频和尿失禁药物的前体原料。(R)-扁桃酸用于合成头孢菌素系列抗生素，青霉素和β-内酰胺阻断剂。因其重要的应用前景和潜在的商业价值，光学纯扁桃酸的制备获得了越来越多的关注和研究。邻氯扁桃酸是制备氯吡格雷的重要手性中间体，而氯吡格雷是一种血小板聚集抑制剂，广泛用于治疗动脉粥样硬化患者因心脏病或中风发作引起的血液凝块。

制备光学纯扁桃酸主要有物理法、化学法和生物法三种方法。物理方法主要由色谱法利用环糊精类衍生物作为基质拆分扁桃酸，成本高，样品处理量小，在工业应用中价值小。化学法使用其它手性试剂对扁桃酸消旋体进行拆分，但拆分试剂价格高，工艺繁琐，产品光学纯度取决于拆分次数。生物法与其它方法相比，效率高，产品光学纯度好，且反应条件温和，环境友好，已经有广泛应用。常见的生物法有利用腈水解酶催化扁桃腈水解反应，酯水解酶催化扁桃酸的酯化产物水解反应和氧化还原酶催化不对称合成反应等。目前生物催化方法主要是催化生成(R)-扁桃酸及其衍生物，生成(S)-扁桃酸的反应实例较少。而利用酯水解酶催化扁桃酸的2-羟基乙酰化产物水解反应的报道更属少数，目前仅有西班牙的Guisan课题组和本课题组有少量研究。我们首次报道了利用假单胞菌酯酶选择性催化扁桃酸的2-羟基乙酰化产物水解制备(S)-扁桃酸和(R)-乙酰氧基苯乙酸。但该细胞催化活性较低，反应时间长。目前尚没有烟曲霉脂肪酶作为催化剂不对称催化制备扁桃酸光学纯物质的报道。

发明内容

本发明目的在于提供一种能够手性水解拆分乙酰氧基苯乙酸生成扁桃酸的烟曲霉脂肪酶基因及其重组脂肪酶；提供利用上述重组脂肪酶生产(S)-扁桃酸和(R)-扁桃酸的用途。针对报道的假单胞菌(Pseudomonas sp.ECU1011)整细胞作为不对称催化剂选择性催化2-乙酰氧基苯乙酸总体催化活性相对不高的缺陷，而提供一种具有优异的不对称催化活性、高反应活性和对环境友好的脂肪酶及其基因，以及含有该基因的重组表达载体，重组表达转化体，该重组酶的制备方法和该脂肪酶或其重组酶的应用。

本发明通过下述技术方案解决了上述问题：

本发明的第一方面提供一种脂肪酶，其氨基酸序列如序列表中SEQ IDNo.2所示。

本发明的该脂肪酶来源于烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293，其较佳的是保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC No.2873。

本发明的第二方面提供一种脂肪酶基因，其(1)碱基序列如序列表中SEQID No.1所示；或(2)编码氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示的蛋白质。

本发明的脂肪酶基因来源于烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293。具体分离方法可为：根据Genbank中收录的烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的脂肪酶基因AFUA_3G14960(Gene ID：3511767)的mRNA序列设计并合成扩增引物；抽提烟曲霉Aspergillus fumigatus Af293的基因组RNA，将基因组RNA反转录为基因组cDNA并以此为模板，利用链式聚合酶反应(PCR)进行基因扩增，获得一条完整的脂肪酶全长cDNA基因序列：核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示的基因，命名为afl67，全长1080bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第1080个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

如本领域技术人员所知，本发明的脂肪酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质的其他任何核苷酸序列。