[发明专利]家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种来自家蚕的具有还原昆虫体内3位脱氢蜕皮激素活性的3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因。

背景技术

昆虫是世界上最成功的动物，其数量和种类最多，分布最广，与人类的关系也非常密切，如作为鳞翅目昆虫代表之一的重要经济昆虫家蚕以及绝大多数农林害虫等。昆虫的表皮(即昆虫的外骨骼)是由蜡质层和几丁质层组成的，其中蜡质层的作用主要是防止水分的蒸发。表皮细胞分泌的外骨骼一经硬化后，就不能继续扩大，从而使昆虫生长受到限制。因此，昆虫在生长发育过程中会出现蜕皮现象。在进行多次蜕皮后， 昆虫幼虫时期的某些组织会消失而产生成虫特异的组织，生活习性也会发生改变，这种变化称为变态。蜕皮与变态是昆虫生长发育的基本生理现象。而昆虫的蜕皮与变态发育主要是由前胸腺合成分泌的蜕皮激素(Molting hormone, MH)和咽侧体合成分泌的保幼激素(Juvenile hormone, JH)协同控制的。因此，理解蜕皮激素代谢机制不仅有助于对家蚕生长发育的控制，对其它鳞翅目害虫的防治也有广泛的指导和借鉴意义。

蜕皮激素的滴度在不同的发育时期呈现精确的、周期性的变化。蜕皮激素的规律性变化对昆虫的发育起着十分重要的作用。昆虫消减体内蜕皮激素浓度主要有两种方式，一是通过排泄排出体外，另外是通过将蜕皮激素转化为非活化形式从而降低体内蜕皮激素的浓度。目前研究证明，有很多转化途径能使蜕皮激素失活(Rees 1995)，例如形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素(3-epiecdysone)。先前研究认为这一失活途径在鳞翅目昆虫中尤为重要。

昆虫中蜕皮激素的3位差向异构化途径主要经过两步：蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase, EO) 的作用下合成3位脱氢蜕皮激素，3位脱氢蜕皮激素最终在3位脱氢蜕皮激素α还原酶 (3dehydro-ecdysone-3α-reductase, 3DE-3α-reductase) 的作用下形成非活性形式3位差向异构化蜕皮激素 (3-epiecdysone)，从而使蜕皮激素丧失活性。另外，3位脱氢蜕皮激素又可以在3位脱氢蜕皮激素β还原酶(3dehydro-ecdysone-3β-reductase, 3DE-3β-reductase)的作用下重新转化成蜕皮激素。在该途径中，3位脱氢蜕皮激素α还原酶是蜕皮激素失活的关键酶，它决定了中间物质3位脱氢蜕皮激素能否形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素。

虽然该酶在蜕皮激素滴度变化过程中起着重要作用，而且其生理、生化性质已经在很多昆虫中有研究。但是，3位脱氢蜕皮激素α还原酶基因及其编码的酶在家蚕中还未见报道。

发明内容

本发明的目的在于利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆并鉴定3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因。将该基因导入真核表达系统中，经诱导使其表达。酶活性测定证实其具有3位脱氢蜕皮激素α还原酶的活性。最后利用转基因手段将该基因转入家蚕体内，通过特异性启动子使目的基因特异地高量表达，从而降低虫体内蜕皮激素的滴度，进而人为地调节家蚕的生长发育。

本发明申请人利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因。利用家蚕5龄3天总cDNA为模板，设计了一对特异的3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase引物，然后进行克隆，得到了一段序列。测序验证为目的序列。然后将该基因连接在表达载体pPIC9K上，并经诱导表达，证实了酶活性，为下一步将该基因导入家蚕中奠定了物质基础。

本发明的家蚕3位脱氢蜕皮激素α还原酶3DE-3α-reductase基因通过以下步骤得到：