[发明专利]家蚕蜕皮激素氧化酶EO基因

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体是一种来自家蚕的具有氧化昆虫体内蜕皮激素活性的蜕皮激素氧化酶EO基因。

背景技术

昆虫的变态发育主要是由前胸腺合成分泌的蜕皮激素(Molting hormone, MH)和咽侧体合成分泌的保幼激素(Juvenile hormone, JH)协同控制的。蜕皮激素的主要作用是引发昆虫在不同的发育阶段有规律地蜕皮，从而决定昆虫幼虫虫体的大小和形态的变化，对于完全变态昆虫来说，在其幼虫的最后一个龄期，幼虫停止分泌保幼激素，在高浓度的蜕皮激素作用下，幼虫完成向蛹的转变，开始昆虫的变态发育。从这可以看出，蜕皮激素在不同的发育时期的滴度是有规律变化的。蜕皮激素的滴度变化对昆虫的发育起着十分重要的作用。昆虫消减体内蜕皮激素浓度主要有两种方式，一是通过排泄排出体外，另外是通过将蜕皮激素转化为非活化形式从而降低体内蜕皮激素的浓度。目前研究证明，有很多转化途径能使蜕皮激素失活(Rees 1995)，例如形成非活性的3位差向异构化蜕皮激素(3-epiecdysone)。先前研究认为这一失活途径在鳞翅目昆虫中尤为重要。

昆虫中蜕皮激素的3位差向异构化途径主要经过两步：蜕皮激素在蜕皮激素氧化酶(Ecdysone Oxidase, EO) 的作用下合成3位脱氢蜕皮激素，3位脱氢蜕皮激素进一步在3位脱氢蜕皮激素α还原酶 (3dehydro-ecdysone-3α-reductase, 3DE-3α-reductase) 的作用下形成非活性形式3位差向异构化蜕皮激素，从而使蜕皮激素活性丧失。其中蜕皮激素氧化酶（EO）是该途径的限速酶。因此，研究EO对于理解昆虫蜕皮激素的周期性变化起着重要作用。

目前为止，蜕皮激素氧化酶的生理、生化性质已经在很多昆虫中有研究。但是，编码该酶的基因的研究却很少。家蚕是重要的经济型昆虫，也是鳞翅目昆虫的模式代表，但是被确认为家蚕蜕皮激素氧化酶基因的研究尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于利用生物信息学、生物工程等方法在家蚕中克隆并鉴定蜕皮激素氧化酶基因。将该基因导入真核表达系统中，经诱导使其表达。酶活性测定证实其具有蜕皮激素氧化酶的活性。最后利用转基因手段将该基因转入家蚕体内，通过特异性启动子使目的基因特异地高量表达，从而降低虫体内蜕皮激素的滴度，进而人为地调节家蚕的生长发育。

本发明申请人利用生物信息学方法在家蚕基因组中鉴定了一个蜕皮激素氧化酶基因。利用家蚕5龄3天总cDNA为模板，设计了一对特异的蜕皮激素氧化酶EO引物，然后进行克隆，得到了一段序列。测序验证为目的序列。然后将该基因连接在表达载体pPIC9K上。并经诱导表达，证实了酶活性，为下一步将该基因导入家蚕中奠定了物质基础。

本发明的家蚕蜕皮激素氧化酶EO基因通过以下步骤得到：

（1）首先以NCBI上已报道的鳞翅目昆虫海灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)中蜕皮激素氧化酶基因（SlEO登录号为AY035784）为问询序列，用Blast程序在家蚕表达数据库(EST)和基因组数据库搜寻家蚕的同源基因。通过信息分析，最终得到一条匹配度最高的基因。该基因的核苷酸序列长2007 bp，有5个外显子，位于家蚕第17号染色体上。该基因编码一个含668个氨基酸的蛋白质，具有典型的葡萄糖-甲醇-胆碱氧化还原酶基因家族结构域，该序列与海灰翅夜蛾的SlEO相似性达到56%，并且该蛋白质具有保守的蜕皮激素结合位点（Leu⁹⁶, Met³⁴⁶, Ala⁴⁴⁶, Thr⁵³³ 和Trp⁵³⁶)。因此，该基因为家蚕蜕皮激素氧化酶的候选基因。基于候选基因的核苷酸序列设计特异性引物，上游为：5' GAATTCATGGTTTGCGGGTTG 3'，下游为：5' GCGGCCGCTCATGCGACATTGAC 3'；划线部分为酶切位点，其中上游引物的酶切位点为SnaB I，下游引物的酶切位点为Not I；

（2）提取家蚕5龄3天幼虫的全蚕RNA，然后将其反转成cDNA，并以其为模板，用设计的特异性引物进行扩增，获得目的条带，PCR产物回收后与PMD-19-T载体连接转化入大肠杆菌DH5a感受态细胞，获得阳性克隆后送往上海生工生物工程公司测序，测序结果表明扩增的序列与预期的结果一致；