[发明专利]一种多功能穿梭表达载体及其构建方法

权利要求书

1.一种多功能穿梭表达载体，其特征是：以pGAPZB为骨架，含有多克隆位点、产甘油假丝酵母的URA3序列及铜抗性筛选标记表达盒。

2.权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述多克隆位点包括Asp718I、KpnI、PmlI、SacII、SfiI、XhoI。

3.权利要求1所述的表达载体，其特征在于所述铜抗性筛选标记表达盒包括上游GAP启动子及下游AOX1终止子。

4.权利要求1-3任一所述的表达载体，其特征在于所述URA3序列如SEQID NO.1所示。

5.权利要求1-3任一所述的表达载体，其特征在于所述铜抗性筛选标记表达盒如SEQ ID NO.2所示。

6.权利要求1所述表达载体的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)克隆产甘油假丝酵母的URA3序列到pGAPZB，构建表达载体pGAPZU；

2)克隆酿酒酵母的CUP1序列到pGAPZB，构建载体pGAPZC；

3)以pGAPZC质粒DNA为模板，设计引物扩增铜抗性筛选标记表达盒，将酵母筛选标记表达盒克隆到pGAPZU的URA3序列一端，获得pGUGCA穿梭载体。

7.权利要求6所述的表达载体构建方法，其特征在于URA3序列的5’端存在两个酶切位点HindIII、HpaI，能将铜抗性筛选标记表达盒插入其中。

8.权利要求1所述的表达载体应用于克隆目的基因，其特征在于在大肠杆菌中使用低浓度Zeocin为筛选标记，在酵母中使用铜筛选标记。

9.权利要求1所述的表达载体应用于整合表达，其特征在于使用载体URA3序列内部的单酶切位点SspI、BstXI等酶切线性化，提高转化效率。

10.权利要求1所述的表达载体应用于整合表达，其特征在于该载体不仅能应用于产甘油假丝酵母，还能应用于酿酒酵母、皱褶假丝酵母等酵母属。