[发明专利]一种中山杉品种302的组织培养繁殖方法

权利要求书

1.一种中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)外植体的选取与消毒：选取当年生顶稍作为外植体，采样时间为当枝条由绿完全转红后第15天至第35天，自来水冲洗干净后，进行消毒；

(2)改良WPM培养基的制备：用Ca(NO₃)₂.4H₂O 684mg/L和KNO₃380mg/L代替原WPM培养基中的K₂SO₄和CaCl₂.2H₂O；

(3)不定芽的诱导：取步骤(1)中处理得到的外植体，切割为0.5-1.0cm长的茎段，接种于诱导培养基中进行不定芽的诱导，培养温度为20-26℃，首先在黑暗中培养20-26小时，然后进行正常培养20-25天；所述正常培养条件为：光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000lx；

(4)继代增殖：将步骤(3)中得到的不定芽分化出的枝条接入继代增殖培养基，进行继代培养25-35天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000lx；

(5)根的诱导：将步骤(4)中所得中山杉无根试管苗进行切割后，接入生根培养基中进行生根培养15-20天，培养温度为20-26℃，光照时间为10-16小时/天，光照强度为1600-2000Lx；

(6)无菌苗的驯化炼苗：将步骤(4)所得中山杉带根无菌苗的培养瓶瓶盖打开，露天培养2-3天，然后移入采用多菌灵(稀释浓度2g/L)消毒的基质中，组培苗上方使用带孔PVC膜覆盖保湿，驯化容器采用50孔穴盘，放在通风阴凉处培养25-30天，培养到第15天将PVC膜移除，换用折光率75％的遮阳网；所述基质成分为体积比1∶1的泥炭土与珍珠岩；

上述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.0-7.0g/L、蔗糖25-35g/L，且pH值为5.8-6.2。

2.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(3)中所述诱导培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素、IBA和GA₃；所述诱导培养基中玉米素浓度为0.5mg/L，IBA浓度为0.2mg/L，GA₃浓度为1.0mg/L。

3.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(4)中所述继代增殖培养基为改良WPM培养基并添加激素玉米素和IBA；所述继代增殖培养基中玉米素浓度为0.3mg/L，IBA浓度为0.2mg/L。

4.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：步骤(5)中所述生根培养基为1/2MS培养基并添加激素IBA；所述生根培养基中IBA浓度为3.0mg/L。

5.根据权利要求1所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(3)中的正常培养时间为20天；所述步骤(4)中的继代增殖培养时间为30天；所述步骤(5)中的生根培养时间为15天；所述步骤(6)中的驯化时间为30天。

6.根据权利要求1至5任一所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述步骤(1)中进行消毒过程为：用清水冲洗干净，用毛刷蘸少许洗衣粉将其表面刷洗干净，再用自来水漂洗3-5次，然后用“安利”洗液震荡漂洗30分钟，接着用自来水流水冲洗30分钟，稀释50倍的84消毒液摇床上振荡消毒10分钟，流水冲洗20-30分钟后，于无菌操作台上用75％乙醇消毒50-60秒，立即倒入0.1％的升汞消毒12分钟，最后用无菌水洗涤4次，每次振荡3-5分钟。

7.根据权利要求1至5任一所述中山杉302组织培养的繁殖方法，其特征在于：所述诱导培养基、继代增殖培养基、生根培养基中均含有琼脂6.5g/L、蔗糖30g/L，且pH值为6.0。