[发明专利]abl基因多态性的检测用探针和其用途

说明书

技术领域

本发明涉及用于检测与白血病相关的abl基因的多态性的探针和其用途。 

背景技术

白血病是由骨髓中的造血干细胞癌化而引起的疾病。已知其中慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia：CML)的发病原因在于9号染色体和22号染色体的易位而形成的bcr-abl融合基因，其治疗中广泛使用作为ABL激酶抑制剂的伊马替尼等。然而，该abl基因(包括前述融合基因中的abl基因)中存在点突变时，存在对伊马替尼表现出耐受性的问题，这种情况下，治疗中需要增加伊马替尼给药量、换成其它治疗药物、改为骨髓移植等等。因此，白血病特别是CML的治疗中，检测abl基因中有无点突变是非常重要的。 

作为abl基因中的点突变的检测方法，可以列举出：对abl基因变异，通过RT-PCR进行扩增、克隆后进行序列解析的方法(PNAS August 6，2002 vol.99 no.16 10700-10705)；用PCR-RFLP法对abl基因变异进行检测的方法(Leukemia(2002)16，2190-2196)；用DHPLC法对abl基因变异进行检测、序列解析的方法(Clin Cancer Res 2006；12(24)December 15，2006)等。然而，PNAS 2002中所述的方法在实验操作方面需要专业知识和技能，难以自动化。此外，实验操作方面也需要花费功夫，至获得结果为止需要数天。Leukemia 2002中所述的方法操作也繁杂，至获得结果为止需要1天左右。此外，有扩增产物污染其它反应之虞(发生污染)。且难以自动化。Clin Cancer Res 2006中所述的方法操作也繁杂，难以自动化。此外，DHPLC法难以区别突变型，需要通过测序法等另行对突变型进行检测。 

由这样的问题出发，近年正在进行利用熔解曲线分析(Tm分析)的检测，来作为基因多态性的检测方法(日本特开2001-286300，日本特开2002-119291)。其为如下方法，即，使用与含有检测目的基因多态性的检测对象序列互补的探针，形成检测试样的目标单链DNA和前述探针的杂交体(双链DNA)，对该杂交产物实施加热处理，通过吸光度等信号的测定，来检测随温度上升的杂交体的解离(熔解)，基于该检测结果确定Tm值，从而判断有无目的多态性。在杂交产物的同源性越高时，Tm值越高，在同源性越低时，Tm值越低。因此，对含有目的多态性的检测对象序列和与其互补的探针的杂交产物预先求出Tm值(评价基准值)，测定检测试样的目标单链DNA和前述探针的Tm值(测定值)，若测定值与评价基准值相同则可以判断为匹配，即目标DNA中存在目的多态性，若测定值低于评价基准值则可以判断为错配，即目标DNA中不存在目的多态性。 

然而，使用这样的Tm分析的检测方法，存在灵敏度低这样的问题。在对白血病患者的血细胞来源DNA进行点突变检测时，这特别成问题(日本特表2004-537992)。即，即使是一个CML患者的血液，其血细胞中也包含abl基因发生点突变的基因(变异基因)和未发生突变的基因(正常基因)，两者的不同仅在于点突变即一个碱基的序列。这样，会发生如下现象：用于检测点突变的探针与含有点突变的变异序列(检测对象序列)杂交(匹配)，还与不含点突变的正常序列(非检测对象序列)进行杂交(错配)。这种情况下，利用Tm分析制作表示信号强度和温度的关系的熔解曲线时存在如下问题：匹配的变异序列所对应的高温侧的峰由于错配的正常序列所对应的低温侧的峰的存在而难以检测。即，就现有的探针而言，即使在含有变异的变异序列存在的情况下，也由于不含变异的正常序列的存在而变得难以检测，存在检测灵敏度降低的问题。 

WO2008/018305中记载了在利用Tm分析的检测方法中使用的、对 abl基因中的点突变即A758T(Y253F)、G756C(Q250E)、G763A(E255K)、和A758T(Y253F)进行检测的探针。此外，日本特开2008-199965中记载了对A730G(M244V)、G749A(G250E)、A943G(T315A)、C944T(T315I)、C951G(F317L)、T1052C(M351T)、A1064G(E355G)、T1075G(F359V)、和A1187G(H396R)进行检测的探针。然而，对T1076G(F359C)、T757C(Y253H)、A764T(E255V)、和G895C/T(V299L)进行检测的探针在所有文献中均没有记载。 

发明内容