[发明专利]小鼠Myogenin基因超表达载体的构建方法及用途

说明书

技术领域

本发明涉及一种小鼠Myogenin(mMyoG)基因超表达载体的构建方法及用途，属于生物和现代农业技术领域的应用技术。 

背景技术

作为肌肉的基本组成单位，肌纤维的类型直接决定肉的品质，但是在成年动物中，不通过肌纤维的新生即可改变原有肌纤维的特性。所以，成年动物肌纤维基因型转化的机制与肌肉分化、生长过程中的机制必定有所不同。肌细胞生成素MyoG是MRFs家族中最重要的成员之一，是一个肌性的bHLH结构的转录因子，在肌肉早期的生长分化过程中发挥着重要作用，在成年动物体内也有表达，但其作用尚不为人知。 

利用pTARGET^TM哺乳动物表达系统构建小鼠MyoG真核表达质粒，对开展MyoG在成年动物肌纤维转化中的作用及对动物肉品质调节功能研究具有重要意义。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，以及该表达载体的用途。 

为了解决上述技术问题，本发明提供一种小鼠MyoG表达载体的构建方法，包括以下步骤： 

1、小鼠MyoG表达载体的构建方法，其特征是包括以下步骤： 

1)、根据载体的信息和靶序列设计并合成2对MyoG mRNA全长引物； 

2)、表达载体的构建：引物退火后与pTARGET^TM载体连接转化，得到小鼠MyoG表达载体的重组质粒。 

作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的改进： 

步骤1)为根据Gene Bank上已知的MyoG基因的mRNA序列(即靶序列)及pTARGET^TM哺乳动物表达载体的要求，设计2对引物，分别为： 

引物I： 

上游引物：5′-GAACAAGCCTTTTCCGACCTGAT-3′ 

下游引物：5′-CAGACAATCTCAGTTGGGCATGG-3′ 

引物II： 

上游引物：5′-GCCGCCACCATGGAGCTGTATGAGACATCC-3′ 

下游引物：5′-TCAGTTGGGCATGGTTTCGT-3′。 

作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的进一步改进：步骤2)为：将引物退火延伸后得到的PCR产物割胶回收，与表达载体pTARGET^TM相连，采用热激转化大肠杆菌JM109。 

作为本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法的进一步改进：对步骤2)所得的重组表达质粒进行鉴定：通过抗生素筛选，将阳性克隆采用PCR和测序鉴定，测序引物为T7引物。 

鉴定目的是确定是否将靶序列正确地连接到载体上面，因为在连接的过程中会出现载体的自连以及连接方向错误等现象。 

本发明还同时提供了利用上述方法构建而得的小鼠MyoG表达载体的用途：用于研究MyoG基因对肉质的调控作用。 

作为本发明的小鼠MyoG表达载体的用途的改进，其包括以下步骤： 

(1)将含MyoG表达载体的大肠杆菌扩培后，提取高纯无内毒素转染级质粒； 

(2)将含MyoG表达载体的高纯无内毒素转染级质粒转染小鼠C2C12成肌细胞等细胞，37℃，5％的CO₂中保温4～6h后更换不含抗生素的培养基； 

(3)转染48h后，分析mMyoG表达载体对mMyoG、肌纤维分型的影响，研究MyoG的功能。 

本发明的小鼠MyoG表达载体的构建方法及其用途，具有以下有益效果： 

本发明根据pTARGET^TM哺乳动物表达载体和NCBI上提供的基因信息，设计两对引物，通过RT-PCR得到mMyoG mRNA全长序列，然后连接到pTARGET^TM哺乳动物表达载体上，热激转化至大肠杆菌JM109，构建得到mMyoG重组表达质粒。本发明所用的表达载体pTARGET^TM方便易得，载体构建方法简单、可行，同时构建的表达质粒能高效地表达目的基因，是研究mMyoG功能的一种较好的研究技术，对开展MyoG在成年动物肌纤维转化中的作用及对动物肉品质调节功能研究具有重要意义。 

附图说明

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。 

图1是RT-PCR扩增MyoG编码区全长电泳检测图；