[发明专利]乙型肝炎病毒核苷类似物耐药突变检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及基因领域，具体是一种乙型肝炎病毒(HBV)核苷类似物耐药突变检测试剂盒。

背景技术

慢性乙型肝炎是一种严重危害健康、威胁生命的进展性疾病。我国约有1.2亿人携带乙肝病毒，其中慢性乙肝患者约3000万例，每年约有35万人死于慢性乙肝相关疾病。在目前的医学条件下，一旦乙肝病毒感染慢性化，就很难将之从体内彻底清除。

近年来，国内外权威的治疗指南都指出，慢性乙型肝炎的治疗目标是长期抑制病毒，延缓疾病进展。越来越多的专家已经认识到，长期的核苷类似物治疗是一个现实的治疗方案，能够帮助患者实现上述治疗目标。然而，过去由于只有拉咪呋定一种口服抗病毒药物应用于临床，治疗的选择受到限制，并因YMDD变异等相关耐药问题受到临床医生的关注。随着阿德福韦酯、恩替卡韦的上市及逐步应用，特别是2006年10月我国《乙肝防治指南》的发布，抗病毒治疗在乙型肝炎治疗中的作用得到极大的重视，而核苷类似物由于其疗效确切、副作用较少、安全可靠、服药方便而在抗病毒治疗中得到越来越普遍的应用。但是，对药物产生耐药性是长期抗病毒治疗过程中不可避免的重要问题。据文献报道，拉咪呋定初治慢性乙型肝炎1年至5年的耐药发生率分别为24％、42％、53％、70％和70％；阿德福韦酯初治患者1年至5年的耐药发生率分别为0％、2％、11％、18％和29％；恩替卡韦的耐药率发生较低，其初治患者1年至3年的耐药发生率分别为0％、0％和＜1％，且往往需在YMDD变异的基础上才出现。一旦产生耐药性变异，往往会发生病毒学的反弹和临床表现的恶化，需要及时调整和更换治疗方案。可以看出，耐药性的发生随着治疗时间的延长而增高，且不少药物之间还存在着交叉耐药性，因此，及时检测并发现耐药性变异的发生，可以有效的评估治疗效果，进一步指导治疗药物的选择，具有重要的临床意义。

目前使用的方法主要检测基因型耐药，包括直接测序、聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)、序列特异性PCR、线性探针杂交技术及基因芯片等，但对各种方法的准确度作对比与评价的报道不多。

其中，基因序列测定是最直接的方法，但过程复杂，成本高。序列特异性PCR特异性不够，临床已基本不用。

PCR-RFLP方法是一种简明和较为完善的方法，以错配PCR结合限制性片段长度多态性方法，快速检测患者体内YMDD变异株的发生情况，该方法通过错配PCR引入独特的酶切位点，再用酶切分析，图谱简单，容易判断。此方法具有较好的可靠性和可行性。由于酶切方法只能检测单点突变，对于可能伴随其它变异需经过测序分析，因此实际应用中应结合PCR-RFLP筛检和PCR产物克隆后测序互相证实和补充。

线性探针杂交技术(LiPA)除了能够对HBV进行基因分型外，能够同时检测耐药株和野生株，结果相对准确，但由于其寡核苷酸探针必须是针对已知的突变位点，一个变异位点可能需要多个探针，无法测得未知变异，得到的信息有限，且价格昂贵。

而基因芯片是将寡核苷酸片段作为探针有序及高(或低)密度地固定于基质载体上，与待测的用荧光(或生物素)标记的待测核酸按照碱基配对的原则进行杂交，经相关检测设备进行结果分析。作为一种高通量的DNA分析技术，可以对众多疾病相关基因、耐药分型及多种疾病病种进行并行的高时效分析，国内外均有应用于YMDD变异检测的成功报道，特别适用于高通量信息的筛查，是今后发展的一个重点方向。

在以上各种检测方法中，直接测序法因其原理简单，重复性好，可以同时检测多个位点的突变，是目前在临床上应用最多的一种方法，已经有商业化的试剂盒销售，也可以在各实验室自行完成，但操作步骤多，检测周期长，费用较高，需要有一定经验的专业人员操作，对病毒载量有一定的要求；而基因芯片作为一种高通量的DNA分析技术，可以对众多疾病相关基因、耐药分型及多种疾病病种进行并行的高时效分析，是一种信息全面、功能强大的基因分析技术。国内已有应用基因芯片检测拉咪呋定相关的YMDD变异，但能同时检测阿德福韦酯、恩替卡韦等多种核苷类似物相关的耐药性变异未见报道，且往往需要对样本核酸进行PCR扩增，国内亦无相关产品。

有关HBV耐药性检测的试剂仍由国外产品主导，且普遍价格昂贵，操作复杂，在国内尚无普遍应用，无法适应我国当前对乙肝病毒耐药性检测的实际需求，而国产商业化的检测试剂仍是空白，因此急需开发出一种操作简便，价格低廉，可以进行快速、准确、高通量检查的检测试剂和仪器。