[发明专利]一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，尤其是一种用于土壤污染生物标记物筛选的动物蛋白质样品的制备方法。

(二)背景技术

蛋白质组学是近年来兴起的一门新兴学科，其主要的技术为双向凝胶电泳(2-DE)和质谱分析技术，可从总体水平上揭示细胞内蛋白的差异表达情况。目前双向电泳一般只能分辨到1000～3000个蛋白质(spot)，而样品中的蛋白种类可达到10万种以上，因此在做双向电泳之前对样品的处理非常重要。样品制备是双向电泳中最关键的步骤，这一步处理的好坏将直接影响2-DE结果。但就目前来说，并没有一个比较标准或者通用的样品制备方法。现在常用的样品制备方法都采用三步法：样品破碎、沉淀蛋白和去除杂质。现有采用的样品破碎手段极易造成样品中蛋白的丢失或导致蛋白被修饰。此外，在蛋白沉淀的步骤也极易引起蛋白的降解和被修饰。去除杂质的技术关键也是尽量减少蛋白丢失和蛋白修饰。由此可见，迄今，蛋白质组学分析中蛋白质样品的制备方法尚没有一个通用的技术，需要经过大量的实验摸索和经验积累才能确保实验结果的可信准确。在研究蛋白的过程中，既需要严谨的技术流程但又不能拘泥于经验。因此，改进实验流程和样品制备技术，减少蛋白丢失、降解(或破坏)和减少对蛋白质的人为修饰或被修饰，减少蛋白质与其他生物大分子的相互作用，并使蛋白质处于完全变性状态。实现低丰度目标蛋白点的高效分离具有重要的意义。

(三)发明内容

本发明提出一种通过组织原位采集和显微放大捕获切割的方法，可以大大减少杂蛋白含量和降解丢失，减少蛋白的人为修饰，在双向凝胶电泳(2-DE)实现动物组织低丰度目标蛋白点的高效分离上效果非常好。

本发明采用的技术方案是：

一种用于蛋白质组学分析的动物蛋白质样品的制备方法，所述方法包括：

(1)组织标本获取：剥离蚯蚓的表皮组织，清洗、用滤纸吸去多余液体，所得组织标本于液氮中速冻后移至-80℃冰箱保存；生物的选择和组织确定：土壤无脊椎动物——蚯蚓，确定组织为表皮组织。

(2)冰冻切片：组织标本从-80℃冰箱取出后，用-30℃的冰冻切片机切片，切片厚度10μm，每例标本第1张切片用HE染色，以后每张切片只做苏木精染色。第1张切片HE染色主要用于组织的识别定位，以后每张切片的苏木精染色是为了确保目标蛋白质在染色的同时还处于完全变性状态；

(3)显微捕获切割：将制备好的切片放在显微镜的载物台上，直视下比较观察选定要切割的区域，按最大捕获效率设定参数，具体为：光束直径(beam diameter)60μm，光束能量(beam power)80mV，激光传递脉冲(transfer pulses)为1.6ms，捕获切割取得40000～50000个细胞，通过软件对所获取的细胞计数；

(4)样本制备：切割下来的细胞加入组织裂解缓冲液中，冰浴振荡30～40min，再1～5℃下超声处理2～5次后，离心(20000×g，1h)，取上清，即得蚯蚓蛋白质样品，贮存于-80℃冰箱备用，同时用考马斯亮蓝法测定提取液中的蛋白质浓度；所述组织裂解缓冲液组成如下：8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L DTT，0.2％两性电解质(Ampholyte电泳级，pH3.0～9.5，Amresco公司)，10ml/L cocktail。

优选的，步骤(4)组织裂解缓冲液组成如下：8mol/L尿素，2mol/L硫脲，4％CHAPS，65mmol/L DTT，0.2％两性电解质，10ml/L cocktail。

在土壤动物生物标记物筛选过程中，可采用上述方法获得蛋白质样品，再按照下述方法进行进一步分析：

(A)双向凝胶电泳：取上述蛋白质样品100μg加入重泡胀液至终体积350μl混匀。将样本均匀加入持胶槽中，胶面向下放入17cm IPG干胶条，滴加矿物油，置于等电聚焦仪上，重泡胀过夜，等电聚焦在19℃下自动进行。等电聚焦后，IPG胶条分别在平衡液A(含20g/L DTT)和平衡液B(含25g/L碘乙酰胺)中各平衡15min，将平衡后的IPG胶条置于12％的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶上方，胶条端滴加宽范围的蛋白标记物，低溶点琼脂糖封闭，电泳参数：5mA/胶1h，待溴酚蓝前沿移入SDS胶时，以30mA/胶6h直至溴酚蓝前沿抵达距胶底边缘约0.5cm时为止。