[发明专利]一种红霉素发酵方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种红霉素发酵方法，属于医药生物领域。 

背景技术

红霉素(Erythromycin，Er)第一代大环内酯类抗生素，主要由链霉菌、小单孢菌和糖多孢菌产生。在临床上主要应用于治疗革兰氏阳性细菌感染，对革兰氏阴性菌如流感杆菌、百日咳杆菌、淋球菌、布氏杆菌、军团菌及脑膜炎球菌等也有抗菌作用。 

红霉素主要活性成分是红霉素A(Er-A)，杂质组分主要有红霉素B(Er-B)和红霉素C(Er-C)、红霉素D(Er-D)、以及红霉素E(Er-E)、红霉素F(Er-F)等，各组分结构式如图1所示。 

红霉素生物合成(图2)的原料是丙酸和甲基丙二酸，活性形式是丙酰-CoA和甲基丙二酰-CoA。丙酸和甲基丙二酸均由初级代谢产物分解而来，甲基丙二酸经PKS酶脱梭也能产生丙酸。六分子的甲基丙二酰-CoA和一分子的丙酰-CoA在聚酮合酶(polyketide synthases，PKS)的催化作用下，经缩合、酮还原、脱水和烯还原等多轮循环后形成红霉素的大环内酯环，即6-脱氧红霉内酯(6-deoxyerthronolide B，6-dEB)。 

6-dEB在C-6羟化酶的作用下形成红霉内酯(erythronolide，EB)。EB在糖基转移酶的作用下，先在C-3位接上第1个脱氧糖L-mycarose，后在C-5位接上第2个脱氧糖D-desosamine，从而形成了具有生物活性的红霉素D(Er-D)。从红霉素D形成红霉素A(Erythromycin A，Er-A)有两种途径，由于C-12羟基化酶(EryK)和甲基化酶(EryG)对底物的亲和力存在差异，主要是通过红霉素D在EryK的催化下形成Er-C，然后在甲基化酶(EryG)的催化下在碳霉糖的C-3’位甲基化而最终形成红霉素A。红霉素B杂质的产生，与EryK催化的羟基化反应进行不完全有关。 

红霉素B杂质活性比红霉素A稍弱，在以红霉素A为原料合成二三代大环内酯类抗生素的过程中，红霉素B也将变成相应的杂质进入产品，极难去除，因此有必要深入研究在发酵阶段就降低红霉素B的含量。 

发明内容

本发明的目的在于公开一种红霉素发酵方法。 

本发明使用的红霉素链霉菌(Streptomyces erythreus)为广东省微生物菌种保藏中心商业上广泛销售的菌种，GIM编号：GIM4.14，其他编号：AS4.198。 

本发明目的是通过如下技术方案实现的： 

将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有20～30体积份种子培养基的三角瓶中，在33±0.5℃的摇床间培养42～50h，摇床转速为220～240r/min；将培养好的种子培养液按照5～10％接种量接入含有20～30体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度33±0.5℃，摇床转速220～240r/min，培养150～210h；即得红霉素发酵物；在发酵培养过程中加入添加剂。 

本发明还可以优选如下步骤： 

将冷冻管中的红霉素链霉菌种子，接入含有25体积份种子培养基的三角瓶中，在33±0.5℃的摇床间培养46h，摇床转速为230r/min，将培养好的种子培养液按照8％接种量接入含有25体积份发酵培养基的三角瓶中，培养温度33±0.5℃，摇床转速230r/min，培养160～180h；即得红霉素发酵物；在发酵24～36h后中加入添加剂。 

所述的种子培养基组分为淀粉3.5重量份，硫酸铵0.75重量份，氯化钠0.5重量份，蛋白胨0.5重量份，糊精2.0重量份，葡萄糖3.0重量份，酵母粉2.0重量份，碳酸钙0.8重量份，硫酸镁0.05重量份，磷酸氢二钾0.08重量份，豆油0.4体积份，用自来水定容到100体积份。 

所述的发酵培养基组分为：淀粉3.0重量份，硫酸铵0.5重量份，糊精4.5重量份，葡萄糖2.0重量份，玉米浆0.1重量份，碳酸钙0.9重量份，豆油0.6体积份，用自来水定容到100体积份。 

所述的添加剂为铁盐、苯巴比妥衍生物、表面活性剂配制而成的组合物；所述的铁盐为氯化铁、硫酸铁、硝酸铁、氢氧化铁中的一种或多种；所述的苯巴比妥衍生物为苯巴比妥钠、甲乙炔巴比妥钠、司可巴比妥、2-硫代巴比妥酸中的一种或多种；所述的表面活性剂为壬基酚聚氧乙烯醚(4-N-NP2EO)、n-辛基-β-D-吡喃葡萄糖苷中的一种或多种。 

所述的发酵液中铁盐的浓度为0.2～5mmol/L；所述的发酵液中苯巴比妥衍生物的浓度为1mmol/L以下；所述的发酵液中表面活性剂的浓度为0.1～0.7mmol/L。