[发明专利]一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法

权利要求书

1.一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，包括以下步骤：

1)从血清样品中提取HCV的RNA；

2)将提取得到的RNA反转录得到cDNA；

3)使用反转录得到cDNA为模板，引物P1:ACTGCCTGATAGGGTGCTTGC（SEQ ID NO：1）， P2:ATGTACCCCATGAGGTCGGC（SEQ ID NO：2）、P3:AGGTCTCGTAGACCGTGCA（SEQ ID NO：3）、P4:CATGTGAGGGTATCGATGAC（SEQ ID NO：4）和P5: TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ ID NO：5）、P6:GAGGAGCAAGATGTTATCAGCTC（SEQ ID NO：6）、P7:TATGAYACCCGYTGCTTTGAC（SEQ ID NO：7）和P8: GAATACCTGGTCATAGCCTCCG（SEQ ID NO：8）分别进行巢式PCR，扩增丙肝病毒的core和NS5B基因片段。

2.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：HCV RNA的提取方法包括如下步骤：

1)在灭菌的1.5mL EP管中加入600 μl RNAiso? Plus，加入血清500μl，涡旋震荡均匀，冰上静置5min；

2)向上述步骤的匀浆裂解液中加入200μl氯仿，盖紧后剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化后，在冰上静置5分钟；

3)4℃，13000rpm高速离心样品15 min后，将上层水相移至新管中，然后加入等体积的异丙醇，冰上放置10min；

4)4℃，13000rpm离心10 min，弃上清，加入600μl使用DEPC水配制的75%（v/v）乙醇洗涤沉淀；

5)4℃，13000rpm离心5min，弃上清，空气干燥RNA 10 min，用10μl  DEPC水溶解RNA，得到用于反转录的RNA。

3.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：RNA反转录的步骤如下：

1)向0.2 μl PCR管中加入1μl Random Primers (25 pmol/μl)，再加入10μl的RNA溶液和1μl RNase Free水，混匀后65℃水浴5min后迅速置冰上冷却2min；

2)简短离心收集变性后的RNA溶液，加入4μl 5×RT Buffer、2μl 10 mM dNTP、1μl ReverTra Ace-α反转录酶(100U/μl)和1μl RNA酶抑制剂（10U/μl），震荡混匀；

3)将反应液放入PCR仪上进行反转录，反应程序：30℃ 10min，42℃ 20min，99℃ 5min，4℃ 5min；

4)离心，得到用于PCR扩增的cDNA。

4.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的外轮反应体系为：10× PCR Buffer 3 μl，2.5 mM dNTP 2 μl，dH₂O 17.6 μl，引物（10 pmol/μl）各1.5 μl，Taq酶（2.5 U/μl）0.4 μl，模板cDNA 4 μl。

5.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的内轮PCR体系为：10× PCR Buffer 3 μl，2.5 mM dNTP 2 μl，dH₂O 19.6 μl，引物（10 pmol/μl）各1.5 μl，Taq酶（2.5 U/μl）0.4 μl，模板cDNA 2 μl。

6.根据权利要求1所述的一种丙型肝炎病毒基因的克隆方法，其特征在于：巢式PCR的两轮PCR反应条件为：94℃预变性5 min；94℃变性30 sec，55℃退火1 min，72℃延伸40 sec，30个循环；72℃延伸10min。