[发明专利]犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法及用途

权利要求书

1.犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法，其特征是包括以下步骤：

1)、穿梭载体质粒的构建：

用QIAfilter Plasmid kit从抗辐射菌Deinococcus radiopugnans中提取质粒pUE30并进行Sph I酶切，用Sph I消化包含有大肠杆菌载体pUC19复制开始领域、大肠杆菌中有活性的Amp抗性基因、抗辐射菌Deinococcus radiodurans中有活性的氯霉素抗性基因的质粒pKatCAT，再与上述pUE30的Sph I消化物混合，用DNA连接酶连接；采用电穿孔法将上述连接物转化大肠杆菌JM109株，从抗Amp的转化株中选择具有pUE30和pKatCAT连接的质粒的株，获得穿梭载体质粒pZT29；

2)、CaIFN-α基因的克隆；获得纯化的犬CaIFN-α基因；

3)、CaIFN-α基因表达质粒的构建：

设计包含限制性内切酶Cla I位点的DNA损伤修复基因rec A的groEL启动子的引物，PCR增幅groEL启动子，在上述穿梭载体质粒的Cla I酶切位点插入groEL启动子构建得到转化子pZT66；

进一步用限制性内切酶EcoT221消化上述转化子pZT66，用T4DNA polymerase进行DNA片断末端的平滑化，将上述纯化的犬CaIFN-α基因顺向插入上述质粒的EcoT221位点，形成犬CaIFN-α基因的表达质粒。

2.根据权利要求1所述的犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法，其特征是：所述步骤3)中的引物如SEQ ID NO：3及SEQ ID NO：4所示。

3.根据权利要求2所述的犬CaIFN-α基因的表达质粒的构建方法，其特征是：所述步骤2)为：

以浙江省地方家犬的血淋巴细胞抽提的基因组DNA为模板，利用RT-PCR技术扩增得到犬CaIFN-α基因；利用1％琼脂糖凝胶电泳进行PCR产物分析，并用Qiagen的PCR纯化试剂盒纯化犬CaIFN-α基因。

4.利用如权利要求1、2或3所述方法构建而得的犬CaIFN-α基因的表达质粒的用途，其特征是：用于合成犬CaIFN-α。

5.如权利要求4所述的犬CaIFN-α的合成方法，其特征是依次包括以下步骤：

1)菌体辐射诱导的时期：菌体生长到36-48h，为进行辐射诱导的最佳时期；

2)照射条件：将菌体培养物置于-射线辐照平台，按剂量率1200Gy/h照射，菌体所接受照射处理的总剂量为600-1200Gy；

3)菌体辐照后培的养条件：经辐照诱导处理后的菌体，在30℃条件下培养30-60min，目的是使菌体在接受外界刺激后，从而大量合成犬CaIFN-α。