[发明专利]一种将抗逆基因导入转基因741杨的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种农杆菌介导的将抗逆基因AtNDPK2导入转双抗虫基因741杨的方法。

背景技术

随着植物转基因技术的日益成熟，越来越多的转基因植物研制成功并逐渐进入市场，我国在林木转基因方面也取得了一定的进展。转双抗虫基因741毛白杨(以下简称转基因741杨)是河北农业大学林学院生物技术实验室和中科院合作，运用农杆菌介导法将Bt杀虫蛋白BtCry1Ac基因和慈菇蛋白酶抑制基因AHPI双价抗虫基因同时转入优良741毛白杨，获得的不同系号转双抗虫基因无性系。室内饲虫试验已确定出高抗株系(室内试虫死亡率＞75％)和中抗株系(室内试虫死亡率40％～75％)^[1]。转基因741杨的成功研制为害虫防治提供了一条新的途径。

在已转入基因的物种中再转入具有其他的功能的新基因，目前还没有研究报道。转基因741杨由中科院微生物所与河北农业大学合作完成。双抗虫基因的导入，使转基因741杨获得了高抗杨扇舟蛾和美国白蛾等主要鳞翅目害虫的能力，大大减少农药施用量。同时通过室内及试验地的饲虫试验，苗期的生长观测和形态观测以及分子生物学检测等方法，最终获得了基本不飞絮的败育雌株转双抗虫基因的优良白杨派杂种，避免了种间的花粉传播，降低了741杨基因污染的风险。

NDPK2基因主要编码植物核苷二磷酸激酶2，近年来的研究表明，NDPK2可参与促分裂原蛋白激酶MAPK级联反应^[2]，进而上调POD、CAT、硫氧还蛋白、硫氧还蛋白还原酶和过氧化物还原酶等多种抗氧化酶基因的表达，调节细胞的氧化还原状态^[3]。从拟南芥中克隆出NDPK2基因，命名为AtNDPK2。AtNDPK2的对大麦、马铃薯的遗传转化研究也表明，AtNDPK2基因的过量表达增强了作物对干旱、盐渍或极端温度的忍耐性。AtNDPK2基因对作物的遗传转化具有重要的实践意义。但迄今为止，未见有关此基因在杨树中遗传转化的报道。

随着环境的不断恶化，植物不仅要受到病虫的危害，而且诸多非生物因素，如干旱、盐碱、低温也严重影响着植物的生长发育和作物产量。杨树是林业最早开展基因工程研究的树种^[4-5]，尤其是转抗逆基因的木本植物在治理盐碱化、沙漠化土地，改善生态环境及增加林业收入等方面，具有草本植物不可替代的优势。随着我国土地荒漠化、盐渍化和冻害的不断加剧，病虫害的不断增加，利用现代生物技术，快速培育兼有抗虫和抗逆植物新品系，是实现扩大种植面积，缓解土地矛盾，减少农药危害的有效途径之一。

发明内容

本文以已转入双抗虫基因的741毛白杨无菌苗的叶片为材料，建立其再生及转基因体系，并通过农杆菌介导法将抗逆基因AtNDPK2导入其中，以期获得即抗虫且抗非生物胁迫能力强的转基因杨树新品系。本发明的技术依据是：

以转基因741杨的叶片为外植体，在已转入双抗虫基因的基础上，采用农杆菌介导的转化方法，将抗逆AtNDPK2基因导入转基因741杨中，获得了即抗虫、又抗逆的转基因杨树，通过对转化条件的优化，建立稳定的遗传转化体系。为杨树抗虫、抗逆品种的培育奠定基础，同时还可以为杨树基因工程操作技术提供参考数据。

本发明涉及到的转双抗虫基因741毛白杨的无菌苗，由河北农业大学林学院提供；

本发明涉及到的根癌农杆菌EHA105，其携带的质粒pCAMBIA1300上含有AtNDPK2基因片段；此菌种由韩国生命工学研究院(KRIBB)提供。

MS(Murashige and Skoog，1962)培养基，是植物组培的常用培养基，广泛用于植物的器官、花药、细胞和原生质体培养，效果良好。本发明所用的植物培养基均以MS为基本培养基，附加了不同的添加剂。

本发明是通过如下步骤实现的：

I制备侵染菌液

挑取农杆菌EHA105的菌落接种到含有潮霉素50mg/L的10～15ml YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养24小时，取10～100μl的菌液转接至30～50ml的YEP液体培养基中，于26℃下，200rpm震荡培养，待菌体OD₆₀₀达到0.8～1.0时，离心收集沉淀，用与离心前等体积的MS液体培养基重新悬浮沉淀后，即得侵染菌液；

II转化

a.预培养：取转基因741杨无菌苗的叶片，在靠近叶柄1/3处沿垂直主脉的方向剪下，并在叶片一侧垂直主脉剪1个伤口，伤口深达主脉，接种在分化培养基上进行预培养2天；