[发明专利]指导B2:B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因

说明书

本申请是申请日为2003年1月31日、中国申请号为03803741.6、发明名称为“指导B2∶B1除虫菌素比例的除虫链霉菌基因”的发明申请的分案申请。

1.发明领域

本发明涉及主要应用于动物健康领域的除虫菌素(avermectin)，例如doramectin，的组合物及有效产生除虫菌素的方法。更具体地，本发明涉及含有编码AveC基因产物的核苷酸序列的多核苷酸分子，其可用于调节除虫链霉菌(Streptomyces avermitilis)培养物发酵所产生的除虫菌素2类∶1类的比例。本发明还涉及除虫链霉菌的载体，转化的宿主细胞，和新型突变株，它们的aveC基因已突变从而调节所产生的除虫菌素2类∶1类的比例。

2.发明背景

2.1.除虫菌素

链霉菌可产生各种各样的次级代谢产物，其中包括除虫菌素，其含有一系列八种相关的能产生有效的抗蠕虫和杀昆虫活性的大环内脂类化合物，有16个成员。这八种截然不同但又密切相关的化合物主要指：A1a，A1b，A2a，A2b，B1a，B1b，B2a及B2b。“a”系列化合物指的是天然除虫菌素，其在C25位的取代基为(S)-仲丁基，“b”系列化合物指的是C25位的取代基为异丙基的那些化合物。代号“A”及“B”指的是C5位取代基分别为甲氧基和羟基的除虫菌素。数字“1”指的是在C22位及C23位为双键的除虫菌素；而数字“2”为C22位有一个氢原子及在C23位有一个羟基的除虫菌素。在这些相关的除虫菌素中，B1型的除虫菌素(如doramectin)被公认为具有最有效的抗寄生虫活性和杀虫活性，因而也是最具商业前景的除虫菌素。

除虫菌素及其由除虫链霉菌菌株需氧发酵而生产的方法在美国专利4,310,519及4,429,042中都已有描述。一般认为天然除虫菌素的生物合成可以通过异丁酸及S-(+)-2-甲基丁酸的辅酶A硫酯类似物来内源启动。

经过随机诱变进行菌株改进并联合使用外源提供的脂肪酸可以有效生产除虫菌素类似物。支链2-氧酸脱氢酶缺陷的除虫链霉菌突变体(bkd缺陷突变体)只有在发酵中补充有脂肪酸时才能产生除虫菌素。筛选和分离支链脱氢酶活性缺陷的突变体(如除虫链霉菌，ATCC 53567)在欧洲专利(EP)276103中已有描述。在有外源提供脂肪酸的情况下发酵这些突变体，导致仅产生四种对应于所用的脂肪酸的除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充除虫链霉菌(ATCC 53567)发酵，结果产生天然除虫菌素A1a，A2a，B1a及B2a；用异丁酸补充发酵，结果产生天然除虫菌素A1b，A2b，B1b及B2b；而用环戊烷羧酸补充发酵，结果产生四种新型的环戊基除虫菌素A1，A2，B1及B2。

用其它脂肪酸补充发酵可以产生新的除虫菌素。通过筛选800多种潜在的前体，已经鉴定出60多种其它新的除虫菌素(例见Dutton等，1991，J.Antibiot.，44：357-365；和Banks等，1994，Roy.Soc.Chem.147：16-26)。此外，5-O-甲基转移酶活性缺陷的除虫链霉菌突变体基本上只产生B类除虫菌素，因而，同时缺少支链2-氧酸脱氢酶及5-O-甲基转移酶活性的除虫链霉菌突变体对应于补充发酵所用的脂肪酸仅生产出B类除虫菌素。因此，用S-(+)-2-甲基丁酸补充这类双重突变体发酵，结果仅产生天然除虫菌素B1a及B2a，而用异丁酸或环戊烷羧酸补充发酵则可以分别产生天然除虫菌素B1b及B2b或新型环戊基B1及B2除虫菌素。用环己烷羧酸补充该双重突变体菌株是产生商业上重要的新型除虫菌素环己基除虫菌素B1(doramectin)的优选方法。这类双重突变体如除虫链霉菌(ATCC 53692)的分离及特性描述在EP 276103中。

2.2.参与除虫菌素生物合成的基因