[发明专利]一种人工透明带及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明属于发育生物学领域，具体地，涉及一种人工透明带。本发明还涉及所述人工透明带的制备方法和用途。此外，本发明还涉及一种培养非人胚胎的方法、一种移植非人胚胎的方法、以及一种非人动物手工克隆方法。

背景技术

手工克隆技术是一项革新性克隆技术，是由Gábor Vajta教授及其同事创建于2001年，并在澳大利亚和南非成功得到了健康克隆牛后代(Vajta G，et al.Production of a healthy calf by somatic cell nuclear transfer without micromanipulation and carbon dioxide incubators using handmade cloning(HMC)and submarine incubation system(SIS).Theriogenology 2004；8：1465-72.)，随后被用在克隆猪的生产，之后在2007年，Y Du等又将该技术成功应用到猪的体细胞克隆中(Y Du，et al.Piglets born from handmade cloning，an innovative cloning method without micromanipulation.Theriogenology 2007；68：1104-10.)。手工克隆技术的主要步骤是：1)卵母细胞体外成熟；2)成熟卵母细胞核去除；3)去核卵母细胞与供体细胞融合成胚胎(重构胚)；4)将重构胚于体外培养，发育至囊胚；5)将囊胚移植于代孕母体。6)囊胚在代孕母体中继续发育成完整个体。其中，在步骤2)中成熟卵母细胞核去除时，先采用pronase链酶蛋白酶进行处理，以消化透明带。

透明带(zona pellucid)是在哺乳动物卵子发生期间形成的、围绕在卵子周围的一层透明的膜状保护层，其由滤泡细胞和卵母细胞的分泌物形成，可启动顶体反应，在受精中起重要作用。在传统克隆技术中，由于有透明带的保护，胚胎在一细胞期就可以移植到体内，所以在体外培养的时间更短，发育能力会更强。但是传统克隆主要依赖显微操作仪，不但操作复杂，对操作人员要求非常高，而且显微操作仪价格昂贵，效率低。

与传统的克隆技术相比，手工克隆技术具有以下优点：它摆脱了对显微操作仪的依赖，所需仪器的成本仅仅是传统克隆的十分之一；操作简单，快速，对操作人员的要求较低；克隆胚胎产出稳定高效。由于操作简单且不依赖于复杂仪器，该技术拥有广泛的产业化前景，是目前唯一可能实现克隆技术自动化的手段。

但是，手工克隆技术由于其固有特点——重构胚(将成熟卵母细胞去核处理，与供体细胞进行融合重新组成的胚胎)的透明带在操作中被消化，失去了透明带的保护，在后续体外培养时容易发生胚胎粘连现象。

Gábor Vajta教授发明的WOW(Well of well)(Vajta G，et al.New method for culture of zona-included or zona-free embryos：the well of the well(WOW)system.Mol Reprod Dev 2000；55：256-64.)方法解决了这一难题，使手工克隆胚能在体外发育到正常的囊胚阶段。WOW方法是在培养盘孔中凿小孔，然后将胚胎放入小孔中培养，这种方法的优点是无透明带的重构胚不会发生粘连现象，能够顺利发育到囊胚阶段。

然而，与传统克隆技术相比，使用WOW方法的手工克隆技术仍然存在不足。一是所打的孔壁没有天然透明带光滑，二是用这种方法只能移植第5-6天处于囊胚阶段的胚胎(这是因为手工克隆技术生产的重构胚一般都没有透明带，在发育早期如果相互接触，彼此会发生粘连现像，长成一团，移到受体中不能发育成完整个体，用WOW方法可使其彼此隔开培养，直至在第5-6天发育成囊胚，这时彼此接触才不会发生粘连现象，移至体内才能继续发育)。本领域技术人员知晓，在胚胎发育过程中，环境非常重要，比如温度，氧气浓度，PH值，渗透压等各种生长因子都能影响胚胎的进一步发育能力，而相比于体外培养，母体显然能提供更全面的营养物质和更适宜的生长环境，因此胚胎在体外停留的时间越短，对其发育越为有利。因此，WOW方法仍然不能很好地满足手工克隆以及胚胎移植的需要。

发明内容

为了解决上述问题，本发明应用琼脂糖(agarose)制造出人工透明带，克服了现有手工克隆技术的固有缺点，实现了能够移植一细胞期的胚胎(例如重构胚)的技术效果。由此提供了下述发明：