[发明专利]一种基于纳米金增强的多种肺癌标志物的高灵敏检测方法

权利要求书

1.一种多种肺癌标志物的高灵敏度检测方法，其特征在于基于纳米金生物复合探针微阵列和纳米金增强，进行检测的步骤是：首先将待测蛋白的捕捉抗体点样到微阵列上，然后在纳米金上标记上待测蛋白的多克隆或单克隆检测抗体，然后将标记好待测蛋白质单克隆或多克隆捕捉抗体的蛋白微阵列及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，洗去没有反应的纳米金探针，加入金增强反应液，肉眼或显微镜下观察、或用CCD扫描拍照，根据灰度值测定相应的蛋白浓度。

2.按权利要求1所述的检测方法，其特征在于具体步骤为：

(a)蛋白抗体微阵列制作

用芯片点样仪将各检测蛋白的抗体及质控点点在醛基修饰的玻璃基片上，室温放置16小时以上，置4℃保存；

(b)构建纳米金生物复合探针

在pH 6～9情况下，纳米金颗粒水溶液可与待测蛋白质相对应的抗体结合，根据胶体金凝集实验确定各抗体的用量，将各抗体与纳米金溶液室温条件下混匀一段时间，再加入质量百分浓度为0.1％-20％的聚乙二醇，4℃过夜，离心，洗去未标记上的抗体，用纳米金重悬液重悬标记好的纳米金生物复合探针，置4℃保存备用；

(c)免疫反应

将标记好各待测蛋白抗体的芯片及纳米金生物复合探针与待测蛋白质样品混合，37℃孵育一段时间，然后再洗去没有反应的纳米金探针；显色

(d)加入金增强反应液后，室温轻摇3-5min，肉眼观测或用CCD拍照。

3.按权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(c)中所述重悬液组成为牛血清白蛋白BSA 0.25-10％、聚乙烯吡咯酮PVP 0.1-1％、蔗糖1.5-10％、聚乙二醇PEG 0.01-1％、吐温Tween20 0.2-1％。

4.按权利要求2所述的检测方法，其特征在于步骤(d)中金增强反应液组成为次氯金酸HAuCl·3H₂O 0.1-100mM、盐酸羟胺NH₂OH·HCl0.1-100mM、明胶Gelatin1-10％，以上均为质量百分浓度。

5.按权利要求1-4中任一项所述的检测方法，其特征在于所述的方法适用于肺癌早期检测和肺癌微转移检测。

6.按权利要求5所述的检测方法，其特征在于检测蛋白质的灵敏度达pg/ml级。