[发明专利]肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒及其使用方法。

背景技术

2011年5月德国爆发肠出血性大肠杆菌（EHEC）感染疫情，根据世界卫生组织的报道，截止6月5日，德国已报告630例HUS病例，死亡15例；1601例EHEC感染病例，死亡6例。此外，欧洲奥地利、捷克、瑞典、丹麦、荷兰、波兰、法国、瑞士、挪威、西班牙、卢森堡和英国等12国共报道31例HUS（死亡1例）和EHEC感染病例73例。美国报道2例HUS病例。

肠出血性大肠杆菌感染是一种人畜共患病，主要引起腹部绞痛和轻度腹泻，一些病例为血性腹泻（出血性肠炎）。多数病人10天内康复，少数病人特别是幼儿和老年人，可出现严重并发症，如以急性肾功能衰竭、溶血性贫血和血小板减少为特点的溶血尿毒综合症（HUS）。一般5%~10%的EHEC感染者可发展为溶血尿毒综合症，病例死亡率为3%至5%。

EHEC致病主要依靠分泌毒素来使人体受到损害。EHEC产生的毒素能使vero细胞产生病变，故称vero毒素；又因与志贺菌的毒素在生物学特性、物理特性和抗原性等方面相似，亦称志贺样毒素（shiga-liketoxin，SLT）或志贺毒素（stx）。志贺毒素在肠道中能够杀伤上皮细胞，并引起严重的炎症反应和广泛的组织病理学损伤，从而导致血痢或无血性腹泻。

EHEC是大肠杆菌的一个亚型，O157:H7是EHEC的主要血清型，此外还包括O26、O111、O103、O113、O117、O128等四十多个血清型，此次引起德国EHEC感染疫情的主要为O104：H4血清型。鉴于EHEC危害的严重性以及覆盖血清型的广泛性，因此准确、快速检测肠出血性大肠杆菌具有十分重要的意义。

传统肠出血性大肠杆菌检测方法，由于其检测周期长、程序复杂、所需试剂繁多等缺点已远远不能满足现代检测要求。以聚合酶链式反应（PCR）技术为代表的病原核酸检测技术在实际应用中存在一些问题，如普通聚合酶链式反应（PCR）技术需要专门的仪器，而且存在容易交叉污染和操作过程烦琐的缺点。而荧光实时定量聚合酶链式反应（real time PCR）技术虽然较好地解决了交叉污染的问题，并简化了操作过程，但却需要更复杂的定量测定仪器，因此不适用于现场快速检测。而且实时定量聚合酶链式反应PCR技术中荧光探针的成本较高，加大了推广应用的难度。免疫学检测技术快速简便成本低廉，但要求高质量高稳定性的单克隆抗体，否则因准确性不够，目前只能是辅助检测手段。所以及时运用生物技术发展的最新成果对满足病原微生物检测要求的不断提高具有重要意义。其中恒温扩增（Isothermal Amplification）核酸快速检测技术是病原核酸检测技术上的长足进步，现已建立起来的环介导恒温扩增技术（LAMP）具有很多的优越性。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足之处而提供一种检测效果更全面、特异性高、漏检率低的肠出血性大肠杆菌检测试剂盒。

本发明的目的可以通过以下技术措施实现：一种肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒，所述的肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒包括以stx 2基因为靶基因、基于环介导恒温扩增技术设计的两对引物：内引物FIP/BIP和外引物 F3/B3。

志贺毒素由原噬菌体所编码，它由 A、B  2 个亚单位组成，stx-A为RNA- N-糖苷酶（RNA- N- glucosidase）催化亚单位，是毒素的毒力区。stxB 为靶受体结合区，可以激发机体的免疫应答，是开发疫苗可选择的重要靶分子。stx可分成2类即stx1和stx2。本专利检测的是stx2基因（GeneBank的gi为25992109），具有很高的特异性。

作为本发明肠出血性大肠杆菌stx2基因检测试剂盒的优选实施方式，所述的两对引物为

外引物F3（1）：（SEQ ID NO 1）

CTTCGTTAAATAGTATACGGACA

外引物B3（1）：（SEQ ID NO 2）

GGCCACATATAAATTATTTTGCT

内引物FIP（1）：（SEQ ID NO 3）

GTGTGGTTAATAACAGACACCGATGTTTTGAGATATCGACCCCTCTTG

内引物BIP（1）：（SEQ ID NO 4）

GGCAGTTATTTTGCTGTGGATATACTTTTATAATCAGACGAAGATGGTCAA

或