[发明专利]多种小分子化合物的同步量子点荧光免疫检测法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于微球的小分子多残留荧光免疫检测方法，特别是涉及一种以量子点为荧光标记物、聚苯乙烯荧光编码微球为固相载体的间接竞争免疫检测法及使用的试剂盒。

背景技术

食品监控工作越来越引起世界各国和公众的高度关注，残留检测技术也一直是国际农产品质量安全领域的一个重要热点。常见的分析方法多为实验室应用的仪器分析法，如气相色谱(GC)、高效液相色谱(HPLC)、薄层色谱法(TLC)、质谱(MS)、串联质谱(MS-MS)以及各方法之间的联用技术等；将免疫化学技术应用在农兽药的残留检测，是近些年发展起来的基于抗原抗体特异性是别的检测技术，如酶免疫分析法(EIA)、荧光免疫分析法(FIA)等。

目前，小分子化合物残留的检测方法一是经典的微生物检测方法，二是现代仪器分析方法，三是免疫分析法。其中，微生物法测定时间长且结果误差较大，仪器分析方法敏感性和自动化程度较高，可定量分析，但操作复杂、费时，还须配备昂贵的仪器，检测成本高，只适合在实验室精确测定，免疫分析法较仪器分析法简单，但目前主要的免疫分析法鲜有能同步检测多种靶标物，这无形中提高了检测费用并拉长了检测周期。因此，开发出准确、快速、高通量的免疫分析方法具有迫切的现实意义和巨大的市场需求。

悬液芯片技术，是基于激光激发荧光的发光类技术之一，又称流式荧光技术、悬浮芯片、液态芯片等，是一个高通量、高速度以及多功能生物技术平台，是20世纪90年代兴起的，它有机地整合了编码微球(encoded beads)、流式细胞技术、激光技术、应用流体学、最新的高速数字信号处理器和计算机运算法则，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。该技术最初在免疫分析方面的应用，主要集中在检测抗体、病毒等大分子。以悬液芯片系统或流式系统作为检测平台的荧光微球量子点免疫分析技术是小分子药物分析领域的一种比较新的检测技术。悬液芯片技术的开发为药物残留分析提供了高效、快速、灵敏的检测方法，对于提高分析效率和未知样品的分析具有非常重要的价值。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于流式技术的编码微球量子点荧光免疫检测法，实现用不同的编码微球和同一种量子点荧光探针可同步检测同一样品中多种小分子化合物抗原成分或者同步检测多个样品中的不同种小分子化合物抗原成分。

本发明的进一步目的是提供了一种在此检测方法过程中使用的检测试剂盒。

本发明是以量子点进行荧光标记，应用于抗原抗体特异性竞争反应的一种荧光免疫检测法，聚苯乙烯微球根据内部包埋荧光染料的比例不同进行编码，选用不同编码的微球作为固相载体，连接不同的捕获抗原，在96孔滤膜板的反应孔中进行反应，同步检测不同样品中的单种或多种小分子化合物，可以克服ELISA只能检测单一靶标物的缺点，旨在提高检测通量，提高检测速度。

本发明的技术解决方案如下：

首先，将合成的蛋白偶联抗原作为捕获抗原共价连接在聚苯乙烯微球上，形成微球-捕获抗原偶联物，在96孔滤膜板上反应孔内，微球-捕获抗原偶联物与待测物中小分子抗原竞争与检测抗体发生特异性反应，其中，与小分子抗原结合的特异性检测抗体经洗涤抽滤而被从反应体系中去除，而与微球-捕获抗原偶联物反应的检测抗体与后续加入的荧光探针(如量子点标记的二抗)进行特异性结合形成微球-捕获抗原-检测抗体-二抗-量子点荧光免疫复合体，经仪器检测荧光信号便可完成检测过程。

所述的蛋白偶联抗原，即捕获抗原，是指将不具备免疫原性的小分子化合物与大分子载体蛋白进行合成，其中大分子载体蛋白可以是牛血清白蛋白(BSA)，也可以是卵清白蛋白(OVA)、钥孔血蓝蛋白(KLH)。

所述微球-捕获抗原偶联物是指使用碳二亚胺法，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基硫代琥珀酰亚胺(NHS)活化微球表面的官能团，然后与捕获抗原上的对应基团反应，从而以共价键方式形成微球-捕获抗原偶联物。

所述检测抗体是指抗待测小分子抗原的单克隆抗体或多克隆抗体，检测抗体可与微球-捕获抗原偶联物发生特异性反应，如果体系中有待测抗原存在则待测抗原也会竞争性地与检测抗体发生特异性结合。

所述量子点标记的二抗是指用量子点作为荧光探针标记的二抗。