[发明专利]一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞染色方法，具体地说，是一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法。

背景技术

对于传统的细胞免疫荧光染色，通常采用细胞爬片或者直接涂片等方法来预处理细胞，再进行免疫荧光染色。而对于悬浮生长的细胞或细胞团，采用细胞爬片处理时，常会出现贴壁状态不佳或在玻片两面都同时生长的情况，影响后期的染色和观察；此外，在后续的染色过程中，附着于爬片的细胞经过多次冲洗后，容易脱落。

中国专利文献CN101329230B公开了一种改进的免疫荧光细胞染色方法，包括固定/通透、通透、表面染色和核内染色、洗涤、重悬共5个步骤，是对eBioscience公司的Foxp3免疫荧光细胞染色方法的改进，将二步多重染色法改为一步多重染色法，同时进行细胞表面染色和核内染色。中国专利文献CN101226118公开了一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法，涉及一种兼容免疫荧光分析的细胞化学染色方法及其用途。中国专利文献CN102043047A公开了一种基于细胞爬片的快速经济的免疫荧光方法。但是关于一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法目前还未见报道。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术中的不足，提供一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案是：一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，所述的染色方法包括以下步骤：先收集细胞于离心管中，800g离心收集细胞，然后分别加入多聚甲醛（PFA）固定、Triton-X100通透、1% BSA封闭，再依次加入一抗、二抗孵育，以上每步操作后都采用800g离心的方法进行洗涤，最后DAPI染色后，滴至载玻片上封片观察。

所述的染色方法包括以下步骤：

a、收集细胞或大细胞团（细胞总数为10⁶-10⁷）于2ml离心管中；

b、加入2ml PBS，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

c、重复b步骤，去除培养基中血清的影响；

d、加入2ml蒸馏水，温和上下颠置，800g离心5min，弃上清；

e、加入1ml 4% 多聚甲醛，放置10min；其间每隔2min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

f、重复b、c、d步骤；

g、加入1ml 0.4% Triton-X-100通透细胞，放置10-20min；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

h、重复b、c、d步骤；

i、加入1ml 1% BSA或山羊血清，室温放置30min，以封闭细胞表面的非特异性抗原；其间每隔5min轻弹管底数次，使细胞充分接触溶液；800g离心5min，弃上清；

j、加入一抗，室温放置2h或者4℃过夜；

k、重复b、c、d步骤；

l、避光加入荧光标记的二抗，室温放置1h；

m、重复b、c、d步骤；

n、加入DAPI和10ul蒸馏水，室温避光放置5min；

o、用移液器将细胞滴至载玻片上，晾干，加含抗荧光淬灭剂的封片剂封片。

所述的细胞为悬浮细胞。

本发明优点在于：

本发明的一种悬浮细胞的免疫荧光染色方法，免疫荧光染色的过程均在离心管中进行，避开了悬浮细胞难于爬片及试验过程容易脱落的问题，染色结果较好，对于悬浮细胞及难于贴壁的细胞，此方法十分适用。

附图说明

附图1是RA诱导后的EB细胞DAPI染核的荧光图片。

附图2是本身带有GFP的RA诱导后的EB细胞荧光图片。

附图3是对RA诱导后的EB细胞进行VASA染色的荧光图片。

附图4是图1、图2、图3的叠加。

具体实施方式

下面结合附图对本发明提供的具体实施方式作详细说明。

附图中涉及的附图标记和组成部分如下所示：

实施例1  

一、实验材料

细胞：小鼠iPS细胞(induced pluripotent stem cells，诱导多能干细胞)，细菌培养皿悬浮培养5天形成的拟胚体（EB）后，添加2um的维甲酸（RA）培养2天后的诱导分化的EB细胞。