[发明专利]一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法

说明书

技术领域

本发明属于免疫球蛋白制备领域，具体涉及一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。

背景技术

单克隆抗体制药是目前生物制药中发展最为迅速的生物技术领域。目前单抗药物研发生产大致分为3类： 1）动物（包括人源化小鼠）直接免疫法; 2）基因文库筛选， 包括噬菌体文库及酵母菌表达文库，等等；3），其它生物学方法。但是这些方法很难生产出纯人源化的，高附着力的单抗药物。

抗体是由哺乳动物B细胞生成的一类蛋白，能够特异性的识别抗原，被称为“生物导弹”。具有单一抗原识别特性的抗体被称为单克隆抗体（简称单抗）。单抗技术发明于上个世纪70年代， 单抗制药起始于上个世纪80年代。单抗技术的基础是免疫鼠类动物获取单克隆细胞株，获得的抗体为鼠源抗体。但是，鼠源蛋白不适合作为人类药物，因此就催生了人源化小鼠技术。但是，免疫人源化小鼠产生的是人-鼠合型抗体，作为人类药物仍然有其局限性。怎样生产纯人源的单抗药物是生物制药的新的挑战。

人体主要免疫细胞分为 T 及B 细胞， B细胞负责生产单抗蛋白， T细胞负责提供B细胞生长发育所需要的信号及细胞生长因子。体外培养并直接刺激免疫细胞生产单抗产物的概念最早在1990年就有报道（In vitro immunization of human B lymphocytes with cultured melanoma cells(SK-MEL 28) Zhang  XM， Borrebaeck CA， Human Antibodies Hybridomas. 1990; 1(1): 42-6）。其试验设计的主体可以简单总结为体外混合培养T及B细胞并导入抗原。该类试验的一个无法回避的难题是大多数的免疫细胞（B细胞）会在大约2周时间内死亡，以至于试验无法进行下去。一个折中的解决方法是用EBV病毒来改造并转化免疫细胞，以避免细胞死亡。然而，EBV 病毒的导入，属于生物污染高危过程，其产生的危害远远大于其正面效果；仅能进行科学实验探索，并不可能应用于生物制药。总体来说，该类试验成功率非常低，几乎不具备可操作性。因此，医药行业需要一种产率高、无生物污染、操作简单的技术制备纯人源单克隆抗体细胞株，再生产出纯人源单克隆抗体。

 

发明内容

本发明提供一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，该方法将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一种混合细胞培养生产纯人源单克隆抗体的方法，将T细胞、B细胞、人体淋巴结内皮细胞进行共同培养，将特异性的免疫细胞经抗原激活，促进B细胞分裂及增值，从而获得抗原特异性的单克隆抗体细胞株，再获得纯人源单克隆抗体。

该方法包括以下阶段：

 A、第一阶段：细胞体外混合培养及刺激：

a. 筛选注射过乙肝疫苗的健康自愿献血者，采集对乙肝疫苗呈免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体 CD-4 T细胞；

b. 将所述的人体CD-4 T细胞用乙肝疫苗抗原短肽进行激活反应，得到激活的人体CD-4 T细胞；

c. 对与A-a步骤中同一乙肝疫苗免疫阳性反应的健康自愿献血者的血液样品进行分离提纯处理，得到人体B细胞；

d.对离体的人体淋巴结样品进行分离提纯处理，得到人体淋巴结内皮细胞；

e.将所述的激活的人体CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞稀释为混合细胞悬液，进行混合培养，并在培养过程中加入抗原进行刺激，得到成熟、增殖的细胞；

所述的混合培养的时间为3周；

所述的刺激的方法为：

将所述的混合细胞悬液按8 mL/每孔的量加入到6孔细胞培养盘内，再加入最终浓度为50-1000 ng/mL的乙肝表面抗原HBsAg；

所述的刺激的时机为：在所述的混合培养的第1天进行第一次刺激；在所述的混合培养的第8天进行第二次刺激；

所述的混合细胞悬液中，所述的激活人体的CD-4 T细胞、人体B细胞、人体淋巴结内皮细胞的终浓度之比为5：20：0.1；

B、第二阶段：细胞融合：