[发明专利]一种用CYP710A11基因培育抗胁迫转基因植物的方法

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及用番茄细胞色素P450基因CYP710A11，通过基因工程等技术手段，培育抗胁迫植物，提高植物耐盐、耐干旱等抗胁迫的能力。

背景技术

已知基因新功能的发掘利用，以及未知基因的功能研究，为拓展基因资源库及有效利用基因资源提供重要的依据，是基因功能研究的重要方向之一。干旱和土壤盐害是威胁全球农业生产最重要的逆境因子。加之气候变化、环境破坏使近年来干旱低温冷冻等极端天气加剧，使受干旱、盐害面积不断扩大，作物生产受到极大威胁。抗逆植物新材料的培育是一个持续而长久的课题，抗逆基因的发掘及利用具有重要意义。

细胞色素P450(Cytochrome P450，简称CYP450，P450)是一类以还原态与CO结合后在波长450nm处有吸收峰的含血红素的蛋白酶类，广泛存在于动物、植物、细菌、真菌等细胞内，是与内质网、线粒体、质体、高尔基体等细胞器膜结合的氧化还原酶类，其编码基因家族，是一个庞大的超基因家族。它们参与多种生物化学反应，其功能主要可归为两大类：1)参与生物合成途径，2)参与生物解毒途径【贺丽虹等，2008】。截止2010年，已鉴定了11500多个P450蛋白【http://en.wikipedia.org/wiki/Cytochrome P450】。

在植物体内，P450基因估计占已知基因的1％【Mizutani M&Ohta D.2010】，是高等植物中最大的酶蛋白家族，广泛地催化单加氧/羟基化反应，合成多种初级和次生代谢产物如苯丙烷类，生物碱，萜类，脂肪酸，生氰糖苷，硫甙类和植物激素等，而且参与许多外源性物质包括除草剂、农药等的生物氧化【MA S&Werck-Reichhart D.2003；Nelson DR，et al.2008】。有关细胞色素P450基因的研究极其繁多，主要集中在它们的生物合成和生物解毒功能上。它们催化产生的一些重要次生代谢产物，在植物抵抗病虫害及生产重要药用价值的天然化合物中，具有重要作用。并能分解有毒物质如除草剂、农药等，使植物抵抗有毒逆境的胁迫【杨致荣等，2003；贺丽虹等，2008】。

迄今仍然有大部分的P450基因的功能未得到鉴定，拟南芥中含有246个P450基因，其中只有约60个通过突变体或者异源表达鉴定了功能，尚有70％未被鉴定【Mizutani M&Ohta D.2010】。目前尚没有关于它们在植物干旱、盐害等非生物胁迫中作用的报道。

在植物基因工程研究中，P450基因的利用，多集中在生产具有重要医药价值的天然化合物【Takemura T，et al.2010；Pfalz M，2011；Jensen K，2011】，提高植物对病原菌的抗性【Cheng DW et al，2010；Griebel T&Zeier J，2010】，提高植物解毒能力如培育抗除草剂新材料【Xia XJ et al，2009；Busi R，et al 2010】，培育能清除污染环境的修复植物【Van Aken B，2009】等。而有关P450用于抗干旱、高盐、低温等非生物逆境的基因工程研究，未见报道。

在植物中，细胞色素P450大家族中CYP710A亚家族基因编码甾醇C-22去饱和酶。目前获得的编码基因有CYP710A1、CYP710A2、CYP710A3、CYP710A4、CYP710A5、CYP710A6、CYP710A7、CYP710A8和CYP710A11。其中CYP710A1～CYP710A4来自拟南芥(Arabidopsis thaliana)，CYP710A5～CYP710A8来自水稻(Oryza Sativa)，CYP710A11来自番茄(Solanum lycopersicum)【Morikawa T.et al，2006；Nelson DR，et al，2004，2008】。其中来自拟南芥的CYP710A1和来自番茄的CYP710A11基因具有相同的功能，编码的甾醇C-22去饱和酶催化β-谷甾醇生成豆甾醇，是甾醇合成途径中的关键酶，在甾醇合成中起重要作用。

在转基因拟南芥中过量表达CYP710A11基因，能提高豆甾醇含量6-28倍【Morikawa T.et al，2006】。另外，CYP710A11在番茄果实成熟过程中表达增加，同时豆甾醇含量也增加【Whitaker BD and Gapper NE，2008】。Morikawa T.等和Whitaker BD等分离克隆的番茄CYP710A11基因在GenBank中的登录号分别为AB223043和EU224275。