[发明专利]一种亲本特异位点测序克隆基因的方法

权利要求书

1.一种亲本特异位点测序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：选用目标性状有差异的材料做亲本，通过两亲本杂交构建分离群体，从分离群体中选择具有隐性性状的个体构建隐性基因池；对两个亲本进行基因组高通量测序，通过初步直接组装并比对，获得显性与隐性亲本特异位点，该特异位点为目标基因的候选位点；通过富集隐性池候选位点并重测序或PCR方式逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点的方式，确定目标基因位点；通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因。

2.根据权利要求1所述的亲本特异位点测序克隆基因的方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状的两亲本杂交后构建分离群体；

(2)隐性池的获得：随机选择分离群体中目标性状为隐性的个体组成隐性池；

(3)DNA提取：取两个亲本的叶片或其它组织，分别提取并获得两个亲本的基因组DNA；从隐性池中每个体上取等量组织混合后提取DNA，或从每个个体中提取DNA后等量混合，获得隐性池DNA；

(4)确定候选位点：按高通量测序流程分别构建亲本文库，PCR并高通量测序；按de novo(直接)组装，初步构建两亲本全基因组，通过比对，分别获得显性亲本与隐性亲本中的特异位点及其等位关系，该位点为目标性状的候选位点；

(5)目标位点的确定：当候选位点超过50个时，通过杂交或PCR方式在隐性池中富集候选位点后再次高通量测序，检测显性亲本中特有的候选位点是否在隐性池中出现，若没有出现，则为目标性状的基因位点；当候选位点不足50个时，采用普通PCR、实时PCR或高通量的OppenArray的检测方式，逐个检查隐性池每个个体的每个候选位点，没有出现的显性座位位点即为目标位点；

(6)基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。

3.根据权利要求1所述的亲本特异位点测序克隆基因的方法，其特征在于，所述亲本杂交构建分离群体是利用遗传距离近的纯系亲本。