[发明专利]一种微生物基因克隆的方法

权利要求书

1.一种微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：用目标性状有差异的菌株做亲本，通过杂交构建分离群体；通过抗性植株、农药、温度、营养元素对分离群体设置选择压进行自动筛选，获得筛选后群体；对两个亲本、筛选前和筛选后群体进行基因组高通量测序；通过初步直接组装并比对，获得亲本间差异位点，并将亲本间差异位点与筛选前和筛选后的群体基因组按完全匹配的方式进行比对，寻找在亲本与筛选前存在、但在筛选后消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点；通过与亲本基因组比对获得基因的全长序列，并利用PCR扩增克隆目标基因，按遗传互补实验验证所克隆目标基因的功能。

2.根据权利要求1所述的微生物基因克隆方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)构建分离群体：利用分别含有相对性状的亲本杂交后分离构建分离群体；

(2)群体自动筛选：按目标性状的特点，选择适合类型的选择压，对分离群体进行自动筛选，获得筛选后群体；

(3)DNA提取：提取2个亲本、筛选前和筛选后2个混合群体的基因组DNA；

(4)目标位点的确定：按高通量测序流程分别构建亲本、筛选前和筛选后基因组DNA文库，PCR并高通量测序；按直接组装，初步构建2个亲本全基因组，通过比对，获得亲本间差异位点；按完全匹配的方式，将差异位点与筛选前和筛选后的混合基因组进行比对，获得在亲本和筛选前群体中存在、但在筛选后群体中消失的位点，该位点为控制目标性状的候选基因位点，若候选基因位点为多个，采用PCR或杂交方式在筛选前和筛选后的群体DNA中富集候选位点，对候选位点重测序，最终确定目标基因；

(5)目标基因克隆与功能验证：通过比对亲本基因组的方式获得基因的全长序列，PCR扩增克隆目标基因，按通用的遗传互补实验验证所克隆基因的功能。