[发明专利]一种批量基因克隆的方法

说明书

技术领域

本发明属于遗传学领域，公开了一种批量基因克隆的方法。

背景技术

自然界物种性状丰富多样，如株高、抗病性、产量等。从孟德尔时代起，就逐渐认识到了性状是由遗传因子控制，摩尔根进一步将遗传因子明确为“基因”，并指出基因位于染色体上且呈线性排列。确定基因在染色体上具体的位置(基因定位)是研究性状的基础，也是分离、克隆并利用基因的前提。

经典的基因定位策略源于摩尔根的连锁理论，即染色体上相邻基因(即基因连锁)不能自由分离，而是倾向于整体向后代传递，它们所控制的性状也倾向于同时出现。二者相邻越近，性状同时出现的可能性越大，重组性状越少。因此，由重组性状(配子)的比例可以度量二者间的距离。若已知道其中一个基因在染色体上的位置(称这样的基因为标记基因)，就可以根据重组率推断另一个基因的位置。例如，黄色圆粒豌豆品种(基因型分别为YYRR)与绿色皱粒品种(基因型为yyrr)杂交产生F₁(基因型YyRr)，F₁自交可能产生YR、Yr、yR和yr 4种配子，根据F₂代的性状表现可以确定它们的比例，进而计算交换率。若交换率为1％，且已知控制颜色的Y基因位于第3染色体上，那么就可以推测，控制豌豆籽粒形状的R基因位于第3染色体且与Y基因相距1cM。从以上的分析可以看出，经典连锁标记定位的实质是找到与目标性状连锁的已知分子标记，并计算二者的交换率，进而推断目标基因的位置。分离群体分池是基因定位的实际操作策略，以上述实例进行说明如下。以籽粒形状为标准，将F₂群体划分为两个部分(池)：显性池(随机抽取的圆粒单株)和隐性池(随机抽取的皱粒单株)，比较豌豆基因组上已知的1000个SSR标记(SSR1-SSR1000)扩增产物在这两个池间的差异。若标记SSR17与籽粒形状R/r连锁，那么对籽粒形状分池，也就相当于对SSR17分池，因此，SSR17在两个池间的扩增产物是有差异的，相反就没有差异，由此确定目标基因与SSR17处于同一染色体。再分析F₂各个单株的表现，计算R/r与SSR17的遗传距离，即可进一步定位R/r在该染色体上的具体位置。

分子标记连锁定位基因经过几十年的发展，已成为基因定位的经典方法，但该方法依旧存在明显缺陷，主要表现如下：

(1)经典分子标记定位克隆基因时，一次杂交与分子标记实验只针对一个目标性状，很难实现一次实验克隆多个基因的目的，效率不高。

(2)大部分物种未开发分子标记，基因克隆还很困难；精细定位区间狭窄，交换率低，计算交换值的实验工作十分庞大；常出现无标记可用，克隆工作无法进行的情况；仅找到含目标基因的区段，需要进行基因预测，假阳性或假阴性的实验结果无法避免。

发明内容

本发明实施例的目的是针对上述现有技术的缺陷，提供了一种利用同一次实验实现多个基因的快速、准确克隆的方法。

为了实现上述目的本发明采取的技术方案是：

一种批量基因克隆的方法，包括以下步骤：选用在多个目标性状上有差异的材料做亲本，将两个亲本杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体，与两个亲本一起基因组高通量测序并进行基因组初步de novo(直接)组装，对两个亲本基因组进行比对，获得亲本间差异等位位点，按不同目标性状，将克隆群体的测序数据归入不同的显性池与对应的隐性池，按完全匹配的方式，比对亲本间差异等位位点序列在显性池与隐性池间的匹配情况，并计算分离比，通过统计检验，获得显性池与隐性池中分离比分别为3∶1和0∶1的等位位点，即获得目标性状的候选位点；扩大隐性池群体，PCR、测序逐个检查隐性池中每个个体的每个候选位点，或隐性池候选位点富集后重测序，隐性池中完全没有出现的显性亲本位点即为目标基因座位，通过PCR扩增克隆全长目标基因，通过遗传互补实验验证目标基因功能。

本发明更具体的技术方案是：

一种基因克隆方法，包括以下步骤：

(1)基因克隆群体的构建与遗传分析：选择多个目标性状上有差异的材料做亲本，通过杂交构建分离群体，从分离群体中随机选择100个以上的基因型作为基因克隆群体；