[发明专利]一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法

权利要求书

1.一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，包括以下步骤：

(1)含TBE的聚环氧乙烷筛分介质的配制：将聚环氧乙烷加入1×TBE缓冲液中，使最终溶液浓度为2.5～3.5％、pH值为7.5～9.0后，搅拌至溶液澄清为止，该澄清溶液用0.22um或0.45um水系微孔滤膜过滤后，即得到聚环氧乙烷筛分介质；

(2)血液样品中基因组DNA提取：在血液样品中加入Tris缓冲液Ⅰ裂解红细胞后，弃去上清，向沉淀中加入Tris缓冲液Ⅱ将细胞团悬浮并加入蛋白酶K，55～57℃水浴孵育2～6h；孵育结束后加入酚-氯仿沉淀蛋白，吸取上清液并在该上清液中加入无水乙醇，得到沉淀DNA；该沉淀DNA经室温自然干燥至恒重时，即得基因组DNA；所述Tris缓冲液Ⅰ与所述血液样品的体积比为1∶2～3；所述Tris缓冲液Ⅱ与所述血液样品的体积比为1∶0.5～1；所述蛋白酶K与所述血液样品的体积比为1∶0.03～0.05；所述酚-氯仿与所述血液样品的体积比为1∶1～1.5；所述无水乙醇与所述血液样品的体积比为1∶1.5～2.0；

(3)需检测基因目的片段扩增：将所述基因组DNA作为扩增模板，采用pp5设计p53基因及k-ras基因目的片段扩增引物，进行常规PCR扩增，即得p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品；

(4)样品处理：将p53基因PCR扩增样品和k-ras基因PCR扩增样品经94～97℃变性8～10min后，冰浴5～10min，得到变性DNA样品溶液；或分别在p53基因PCR扩增样品、在k-ras基因PCR扩增样品中加入三蒸水、Tango缓冲液，并在p53基因PCR扩增样品中加入MspⅠ内切酶、在k-ras基因PCR扩增样品中加入BstNⅠ内切酶，在37℃孵育4～8h，在80℃灭活15～20min后，得到酶切DNA样品溶液；所述p53基因PCR扩增样品、k-ras基因PCR扩增样品分别与三蒸水、Tango缓冲液的体积比为1∶1.5～1.8∶0.2～0.3；所述p53基因PCR扩增样品与所述MspⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；所述k-ras基因PCR扩增样品与所述BstNⅠ内切酶的体积比为1∶0.1～0.2；

(5)样品检测：

①在17～22ul变性DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μl；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-SSCP检测即可；

②在17～22ul酶切DNA样品溶液中分别加入10×SYBR Green I荧光染料、所述步骤(2)所得的基因组DNA，混匀后加入去离子水至体系为30～50μ1；然后，使用毛细管电泳仪压力系统自动填充所述聚环氧乙烷筛分介质，在分离电压为10～20kv、温度为15～20℃的条件下采用负极-10kv电动进样的方式进行CE-RFLP检测即可。

2.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(1)中的1×TBE缓冲液是指将在800毫升去离子水中分别加入三羟甲基氨基甲烷10.8克、硼酸5.5克、乙二胺四乙酸二钠盐0.74克经搅拌溶解后，加去离子水将溶液定容至1升所得的缓冲液。

3.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的血液样品是指胃癌、肺癌患者及正常人外周静脉血液样品。

4.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅰ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA和25mL/L的聚乙二醇辛基苯基醚混合而成的缓冲液。

5.如权利要求1所述的一种用于检测血液中肿瘤突变基因的方法，其特征在于：所述步骤(2)中的Tris缓冲液Ⅱ是指由pH值为8.0且10mmol/L的Tris-HCl缓冲液、10mmol/L的氯化钾、10mmol/L的氯化镁、pH值为8.0且2mmol/L的EDTA、0.4mol/L氯化钠和10g/L十二烷基硫酸钠混合而成的缓冲液。