[发明专利]甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法无效
| 申请号： | 201110218585.0 | 申请日： | 2011-08-02 |
| 公开（公告）号： | CN102329858A | 公开（公告）日： | 2012-01-25 |
| 发明（设计）人： | 沈万宽;姜子德;邓海华;习平根;刘睿;李敏慧;陈健文;杨湛端;陈仲华 | 申请（专利权）人： | 广州甘蔗糖业研究所;华南农业大学 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68;C12Q1/04;C12R1/645 |
| 代理公司： | 广州市红荔专利代理有限公司 44214 | 代理人： | 唐弟 |
| 地址： | 510316 广*** | 国省代码： | 广东;44 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 甘蔗 黑穗病 菌巢式 pcr 快速 检测 方法 | ||
1.甘蔗黑穗病菌巢式PCR快速检测方法，其特征在于包括以下步骤：
步骤A、基因组DNA提取：采用CTAB法提取甘蔗叶片或甘蔗黑穗病菌基因组DNA；
步骤B、第一轮PCR扩增：以步骤A得到的DNA样品为模板，采用真菌核糖体基因转录间隔区ITS的通用引物ITS4和ITS5经过PCR扩增得到第一轮PCR扩增产物；
引物序列号：ITS4：5`-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3`；
ITS5：5`- GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3`；
PCR反应体系：基因组DNA 1μL，Taq酶0.2μL（5U/μL），10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5μL，各2.5mmol/L dNTPs混合液2μL，5 μmol/L的ITS4引物1μL, 5μmol/L的ITS5引物1μL，灭菌超纯水补足至25μL；
PCR扩增程序：预变性94℃，5min；30次循环94℃，30s→56℃，40s→72℃， 1min；延伸反应72℃，10min;保存4℃；
步骤C、第二轮PCR扩增：以第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液为模板，采用甘蔗黑粉菌核糖体基因转录间隔区ITS的特异引物Smut-L1和Smut-R2经过PCR扩增得到第二轮PCR扩增产物，
引物序列号：Smut-L1：5`- CTAGGGCGGTGTTCAGAAGCAC -3`；
Smut-R2：5- CAGTGCACGAAAGTACCTGTGG -3`；
PCR反应体系：取1μL第一轮PCR扩增产物或者第一轮PCR扩增产物的稀释液作为模板，取5μmol/L的Smut-L1引物和5μmol/L的Smut-R2引物各1μL, Taq酶0.2μL（5U/μL），10×PCR反应缓冲液（含Mg2+）2.5μL，各2.5mmol/L dNTPs混合液2μL，灭菌超纯水补足至25μL；
PCR扩增程序：同步骤B的反应程序；
步骤D、PCR扩增产物检测：采用凝胶电泳方法对经步骤C得到的PCR扩增产物进行分析。
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