[发明专利]苹果牛眼果腐病菌分子标准样品及其制备方法

权利要求书

1.苹果牛眼果腐病菌分子标准样品，其特征是：以苹果牛眼果腐病菌菌株提取高纯度DNA为原料制得，标准样品具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管的含量5μg±0.5μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8～2；（4）易溶于水，或TE（Tris-EDTA）缓冲液中。

2.根据权利要求1所述的苹果牛眼果腐病菌分子标准样品，其特征是： DNA纯度：OD260/280=1.99。

3.苹果牛眼果腐病菌分子标准样品的制备方法，其特征是：包括如下步骤：

（1）苹果牛眼果腐病菌 菌株采用马铃薯蔗糖液体培养基，置于20～22℃条件下培养5～7天；

（2）提取苹果牛眼果腐病菌 DNA，采用CTAB方法提取DNA；

（3）核酸标准样品的制备:将测定浓度后的DNA按5μg±0.5μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装100-400管，然后冻干，即为目的标准品。

4.根据权利要求3所述的苹果牛眼果腐病菌分子标准样品的制备方法，其特征是：所述提取苹果牛眼果腐病菌DNA，包括如下步骤：

①取0.1 g干菌丝置于预冷的研钵中，在液氮中迅速研磨成粉末状，把粉末迅速转入1.5 ml 的离心管中；

②向①中装有干菌丝粉末的离心管中加入800 μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液，涡旋振荡充分混匀，65℃水浴50 min，每隔 10 min轻轻颠倒混匀一次；

③冷却至室温，再向②中离心管加入800μl的氯仿：异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，静置10 min，4℃10000 rpm离心10 min，取上清；

④向③中所得上清液中加入与该上清液等体积的氯仿：异戊醇混合液，轻轻颠倒混匀，静置10 min，4℃10000 rpm离心10 min，取上清；

⑤向④中所得上清液中加入与该上清液等体积的异丙醇或2倍体积冰无水乙醇，轻轻颠倒混匀，出现DNA絮状沉淀，放在冰上放置30 min沉淀DNA，4℃12000 rpm离心10 min，弃上清，离心管倒置滤纸上干燥，用800μl浓度 70 %冰乙醇清洗沉淀两次，以除去盐离子等；加入800μl浓度 70 %冰乙醇后，轻轻颠倒离心管几次，将沉淀于底部的DNA弹起，放置离心管10 min，4℃10000 rpm离心1 min，弃上清；再用800μl 浓度70 %冰乙醇洗DNA沉淀，方法同上，4℃15000 rpm离心3 min，弃上清，风干去除乙醇；

⑥向⑤中所得DNA沉淀中加入200μl TE溶解DNA沉淀，待充分溶解后，加入3 μl RNase(10 mg/ml)，37℃水浴30 min；然后按③－⑤步相同处理方法进行处理；

⑦将第⑥步处理后的干燥DNA沉淀,用100 μl TE溶解，-20℃保存备用。

5.根据权利要求3或4所述的苹果牛眼果腐病菌分子标准样品的制备方法，其特征是：对标准样品定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA：

    取制备的核酸标准样品，加入50μlTE，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物PhomⅠ和PhomⅡ进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

正向引物: 5'- CTTTCTCCGTTGTCCCATCC -3'

              反向引物: 5'- GAACATTGCGCATCTGGTCC -3'

反应体系：

              模板        1～2 μl

              正向引物    1 μl

              反向引物    1 μl

              Taq酶       0.2U

              dNTP         4 μl

              10×Buffer   3 μl

              Total        30 μl

反应条件：

        94℃ 2min

        98℃ 10s

        57℃ 30s

        72℃ 30s   循环35次

        72℃ 10min。

6.根据权利要求4所述的苹果牛眼果腐病菌分子标准样品的制备方法，其特征是：所述提取苹果牛眼果腐病菌DNA中采用的氯仿：异戊醇混合液体积比为24：1。