[发明专利]厩腐蝇分子标准样品及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及厩腐蝇分子标准样品及其制备方法和应用，属于卫生检疫技术研究领域。

背景技术

国内外关于媒介生物分子DNA标准样品的研究则尚处于起步的阶段，很多问题都亟待解决。由于受生物发育阶段的限制以及近缘种生物形态的相似性、实际工作中样品的不完整性等原因，传统的形态学手段进行物种鉴定遇到很多实际困难。现有分子DNA技术被证明是一个行之有效的生物鉴定手段。目前，我国还没有经过国家认可的、统一的、规范化的厩腐蝇分子DNA标准样品，在国际上也没有该类标准样品。因此，本项目研制的厩腐蝇标准样品将为厩腐蝇分子鉴定工作提供参照和依据，为我国分子标准样品的研究工作起到一定的推动作用。

发明内容

本发明目的是提供厩腐蝇分子标准样品，均匀性稳定性良好，另外本发明还提供标准样品的制备方法，工艺简单，易于制备。

本发明厩腐蝇分子标准样品，以野外采集厩腐蝇成虫通过实验室条件饲养后，提取高纯度DNA，进行分装、冻干，得到厩腐蝇的分子标准品，其具有下述的理化性质：（1）形状：纯白色粉末状；（2）每管含量1μg ± 0.1μg；（3）DNA纯度：OD260/280=1.8～2.0；（4）易溶于水或TE（Tris-EDTA）缓冲液中。

所述DNA纯度：OD260/280=1.85。

本发明厩腐蝇分子标准品的制备方法，包括以下步骤：厩腐蝇分子标准样品的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：

第一步、厩腐蝇DNA提取：野外采集厩腐蝇成虫，在实验室条件下饲养，提取厩腐蝇DNA，采用试剂盒提取DNA：

（1）用研磨棒进行匀浆：

取1~100mg的厩腐蝇组织移入冰浴预冷的离心管中，用研磨棒快速研磨成糊状；

加入350μL的Solution Ⅰ 和0.9uLRNase A1后用研磨棒快速研磨成匀

浆；

加入350μL的Solution Ⅰ将研磨棒上的匀浆冲入离心管中，充分振荡混合后，65℃保温5分钟；

（2）加入400μL的Solution Ⅱ，振荡混合；

（3）加入1mL的4℃预冷的Solution Ⅲ，充分混匀后，12,000 rpm离心2分钟；

（4）弃去上层有机相，再加入1mL的4℃预冷的Solution Ⅲ，充分混匀后，12,000 rpm离心2分钟；

（5）弃去上层有机相，然后将水相溶液（无色下层）转移至置于离心管上的滤杯中，12,000 rpm离心1分钟；（注：有机相（上层）带有颜色，请务必除尽，否则会阻碍DNA结合到DNA制备膜上，相见沉淀不用考虑，在过滤时将被去除。）

（6）弃滤杯，在滤液中加入400μL的DB 缓冲液，混合均匀；

（7）试剂盒中的旋转柱安置于离心管上。将上述操作6混合溶液转移至旋转柱中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液；

（8）将500μL的Rinse A加入至旋转柱中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液；

（9）将700μL的Rinse B加入至旋转柱中，12,000 rpm离心30秒钟，弃滤液；（注：                                                请确认Rinse B中已经加入指定体积的100%乙醇。请沿旋转柱管壁四周加入Rinse B，这样有助于完全冲洗沾附于管壁上的盐份。）

（10）重复操作步骤（9）；

（11）旋转柱安置于新的1.5mL的离心管上，在旋转柱膜的中央处加入50~200μL的灭菌蒸馏水或洗脱 缓冲液，室温静置1分钟。（注：把灭菌蒸馏水或洗脱 缓冲液加热至65℃使用时有利于提高洗脱率。）

（12）12,000 rpm离心1分钟洗脱DNA；-20℃保存备用；

第二步、核酸标准样品的制备:

 将测定浓度后的DNA按1μg± 0.1μg /管进行分装，每种核酸分子标样分装150管，然后冻干，即为目的标准品。

所述对制得的标准样品进行定性鉴定，通过特异性引物进行PCR扩增或测序进行定性分析，来确认所制备的核酸为目的DNA；取制备的核酸标准样品，加入50μLTE，溶解后作为模板使用，经采用特异性引物28SrRNA-1和28SrRNA-2进行PCR并测序，进行定性分析，确认所制备的核酸标准样品为目的核酸样品；

上游引物: 5’-GACTACCCCCTGAATTTAAGCAT-3’

下游引物: 5’-GACTCCTTGGTCCGTGTTTCAAG-3’