[发明专利]双羰基还原酶突变体及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种可用作手性醇合成催化剂的双羰基还原酶(diketoreductase，DKR)的突变体。

背景技术

生物催化是迄今为止人类所知的最高效和最具有选择性的催化体系。生物体中的酶能以超出人们想象的高速度催化各种生化反应。酶不仅在生物体内，也能在生物体外促进天然和人工合成的化学分子的诸多转换反应，并且显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。与传统的化学合成相比，生物催化反应所要求的的反应条件一般比较温和：常温、常压、中性或者接近中性pH。因此，生物催化是最有发展前景的“绿色”合成手段之一。

对134种工业的生物转化进行分析，发现水解酶(44％)和生物催化的氧化还原(30％)是最常见的工业应用，其中有89％是生物合成手性化合物(参见：Curr Org Chem，2010，14：1447-1460)。在大量的手性化合物中，具有光学活性的手性醇是一类重要的中间化合物，广泛应用于手性药物、农药以及其他手性化学品的合成。现在获得这些手性醇化合物的一个重要的方法，就是通过脱氢酶和还原酶生物催化还原相应的手性前体酮而得到。不过，现在人们所掌握并能应用的酶的数量还很有限，使得很多手性醇的合成反应还没有找到合适的生物催化剂。例如，2-氯-1-苯乙醇是一种重要的手性β-卤代仲醇，其取代基团上的卤素易于脱去，可作为手性药物前体参与构成手性环氧化物以及氨基醇类(参见：Chiral chemistry(2004)24)。在工业生产中，一般利用Baker’s Yeast由α-氯乙酰苯还原生成(R)-2-氯-1-苯乙醇(参见：Tetrahedron(1991)47：2073-2080)。(S)-2-氯-1-苯乙醇则可以由海洋真菌催化α-氯乙酰苯的还原反应而得到。然而，这类海洋真菌的催化条件比较苛刻，只有在类似海水的环境中才能产生活性，且产率和立体选择性都较差(参见：Biotechnol Lett(2009)31：1559-1563)。目前，可用于催化α-氯乙酰苯生成高光学纯度2-氯-1-苯乙醇的酶鲜有报道。

公开号为CN 101429514A的中国发明专利申请公开说明书公开了一种可用于制备3R，5S-双羟基化合物的双羰基还原酶。所述双羰基还原酶能够催化双羰基化合物的还原反应，例如使3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯生成3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，同时该生物催化反应具有高度立体选择性(参见：Nature Precedings.http://hdl.handle.net/10101/npre.2008.1697.1或Acta Biochim Biophys Sin.(Shanghai)(2009)41：163-170)。随后，Wu et al.也对双羰基还原酶的底物谱进行了研究，发现该酶在催化单羰基底物还原的反应中也是良好的催化剂(参见：Tetrahedron：Asymmetry(2009)20：2504-2509)。不过，在催化α-氯乙酰苯生成2-氯-1-苯乙醇的反应中，表现出来的立体选择性较差，仅能获得ee为3.91％的R构型产物。

酶的催化功能可通过改变其特定的结构而改善。酶的催化活力只集中表现在酶的活性中心内的少数特异氨基酸残基，这些是酶发挥催化作用与底物直接作用的有效基团。双羰基还原酶是羰基还原酶中的一种。这类酶在结构上主要由两个结构域组成，分别是与NADH或NADPH结合的辅酶结合结构域，以及与底物结合的结构域。与底物结合的结构域由不同理化性质的氨基酸组成，决定了酶催化的底物的特异性。

因此，需要寻找和发现可提高酶立体选择性和催化效率的双羰基还原酶突变体。

发明内容

本发明的发明目的是提供一种双羰基还原酶突变体，提高其立体选择性和活性。

为达到上述发明目的，本发明采用的技术方案是：一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的氨基酸序列与SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.20所示任一氨基酸序列具有80％以上的同源性。

一种双羰基还原酶突变体，所述双羰基还原酶突变体的核苷酸序列与SEQID NO.21～SEQ ID NO.40所示任一核苷酸序列具有80％以上的同源性。

优选的技术方案中，所述双羰基还原酶突变体对应野生型双羰基还原酶中的氨基酸的突变情况选自以下任意一种：