[发明专利]一种感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明涉及细菌鉴定技术领域，具体涉及一种利用锁定核酸荧光定量PCR法进行感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒。 

背景技术：

感染性疾病目前仍是危害人类健康的最主要的一种疾病，各种感染性疾病许多都是由病原微生物引起的，其中由细菌和病毒引起的疾病是临床最常见的疾病形式。鉴定感染源和致病因子可为疾病提供明确的诊断，并指导临床用药。准确及时的细菌学报告，可以减少病人的住院时间，降低病死率及病人经济负担。 

目前细菌学检测主要是通过基于培养的菌种鉴定实验，包括自动化细菌鉴定仪及各种生理生化实验。但由于目前的方法一般是基于培养技术，因此耗时较长，约2-3天才能获得结果，而且灵敏度较差，因此，临床亟需快速灵敏的实验方法来进行细菌鉴定，特别是对于危重疾病，例如菌血症等，快速准确灵敏的方法可指导临床治疗方案，以控制细菌的传播和扩散。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种临床常见感染细菌的鉴定技术和检测试剂盒，它鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。 

为了解决背景技术所存在的问题，本发明采取以下技术方案：感染细菌的鉴定方法为：利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测 细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。 

所述的扩增待测细菌特异基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50个核苷酸。 

所述的鉴定细菌锁定核酸探针的大小均为8-20个核苷酸。 

所述探针序列5’端连接上荧光素，3’端连接上萃灭剂。 

所述的荧光素为一种荧光报告基团，包括FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY5、CY5.5、Red 640、CAL Red、FITC。 

所述的萃灭剂是可以萃灭荧光的基团，包括TAMRA、DABCYL、NFQ。 

所述的检测试剂盒包括扩增细菌特异基因及特异基因的正反向引物对、与细菌特异基因及特异基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针、进行PCR反应和分子杂交的反应液。 

本发明具有以下有益效果：它鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。 

附图说明：

图1为本发明的细菌鉴定试剂盒包括的引物的结构示意图； 

图2为本发明的细菌鉴定试剂盒包括的锁定核酸探针的结构示意图； 

图3为多重不对称PCR扩增热循环程序的结构示意图； 

图4为实施例中不同浓度大肠杆菌扩增标准曲线图； 

图5为实施例中大肠杆菌扩增曲线图。 

具体实施方式：

参照图1-3，本具体实施方式采取以下技术方案：它的鉴定方法 为：利用特异引物对进行实时荧光PCR，扩增待测细菌特异基因，扩增产物与锁定核酸探针进行杂交，检测荧光信号，确定待测细菌特异基因。 

所述的扩增待测细菌特异基因的引物对的正向引物和反向引物的大小均为15-50个核苷酸。 

所述的鉴定细菌锁定核酸探针的大小均为8-20个核苷酸。 

所述探针序列5’端连接上荧光素，3’端连接上萃灭剂。 

所述的荧光素为一种荧光报告基团，包括FAM、TET、JOE、VIC、HEX、ROX、TAMPA、CY3、CY5、CY5.5、Red 640、CAL Red、FITC。 

所述的萃灭剂是可以萃灭荧光的基团，包括TAMPA、DABCYL、NFQ。 

所述的检测试剂盒包括扩增细菌特异基因及特异基因的正反向引物对、与细菌特异基因及特异基因的扩增产物杂交的锁定核酸探针、进行PCR反应和分子杂交的反应液。 

本具体实施方式鉴定快速准确，灵敏度好，可指导临床快速控制细菌的传播和扩散，提高临床医师用药水平并保证病人的安全。 

实施例：1、本试剂盒检测细菌的目标包括：大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、金黄色葡萄球菌、凝固酶阴性葡萄球菌、粪肠球菌及屎肠球菌，(引物和探针的详细信息如图1，图2)

2、细菌培养与核酸提取，使用大肠杆菌标准菌株ATCC 25922进行试验，在超净工作台内将细菌划线接种于LB培养基平板以分离单菌落，将平板在孵箱中倒置，35℃孵育24h，从培养细菌的LB平板上沾取一单菌落，加到100μl 1×TE中。然后将离心管95℃水浴5min，置-20℃备用。