[发明专利]DiI 显微颗粒简易制作及其标记神经元的方法

说明书

【技术领域】

本发明属于生物医学实验领域，适用于生理、病理条件下动物的离体脑片上特定脑区神经元标记，以便对神经元形态及其变化、神经元树突棘数目等进行显微观察、定性和定量分析。 

【背景技术】

以荧光染料标记特定脑部位神经元，并借助荧光显微镜或激光共聚焦显微镜对这些标记的神经元进行形态学定性或树突棘的量化研究，对于分析神经元之间联系、神经信号处理、神经系统疾病病理都是不可或缺的生物医学实验技术，几乎所有进行神经科学研究的实验室都需要应用此类技术。亲脂性羰花青染料(lipophilic carbocyanine dyes)能够清晰标记神经元形态细节，是在神经科学实验中十分重要而常用的一类荧光示踪剂。此类荧光染料包括种类较多，具有极强的亲脂特性，当以合适的技术给予脑组织后，它们会接触到细胞膜，掺入其中并沿着细胞膜扩散，从而完整地勾勒出细胞轮廓，达到标记、显示神经元的目的。 

DiI(英文：1，1′-dioctadecyl-3，3，3′，3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate)就是最常用的一种亲脂性羰花青染剂。目前，应用DiI标记神经元时，常采用向组织注射溶液或埋入固体两种形式进行给药。如果使用注射溶液的方法给药，则DiI与其它非羰花青类神经元示踪剂在具体给药技术和神经元标记效果等方面没有太大差异。但是，当将固体DiI埋入活的或固定的离体脑切片后，则该染料可以十分清晰显示单个神经元形态，藉此可以对神经元进行动态或静态观察，分析神经元树突棘的形态、数目变化等。此类技术应用十分广泛，在 标记神经元方面具有其它标记技术所无法比拟的优点。然而，该技术的关键是：埋入脑组织中的DiI荧光染料颗粒要尽可能小，只有当其大小在数个微米的条件下，才可能高清晰的标记出单个神经元。如若埋入脑组织的DiI染料颗粒过大，显微镜下只能观察到以固体染料为中心的波及较大脑组织范围的超强荧光区域，根本不能显示单个神经元形态。因此，如何得到DiI的显微颗粒，就成了制约该类实验成功的瓶颈。 

目前，医药公司生产的DiI颗粒体积过大(大者可达到数个毫米大小甚至更大)，根本不能直接用于以固体颗粒埋入脑组织的方法标记单个神经元。为保证DiI的标记效果，实验者只能从购买的DiI晶体中(或将购买的DiI机械研磨)于显微镜下挑选出尽可能小的晶体颗粒。条件好的实验室会自己制作染料“枪弹”。其基本步骤是首先用DiI包裹微米级的钨微粒，制成染料的“枪弹”，并装入专门制作的“基因枪”内，再将染料“枪弹”射入特定脑结构内，标记神经元。这一技术的缺点是“枪弹”制作过程复杂、成本高、技术难度较大并需要“基因枪”。因此，研究人员希望有一种简便易行、成本低廉、操作方便的制作DiI显微颗粒的技术并用之高质量标记神经元技术。 

【发明内容】

本发明的目的是提供一种成本低、便于操作和实现的DiI显微颗粒制作方法以及利用这些颗粒高质量显示单个神经元形态的生物医学方法。 

为了实现上述目的，本发明一种DiI显微颗粒简易制作方法采用如下技术方案： 

一种DiI显微颗粒简易制作方法，包括以下步骤： 

将DiI颗粒溶解于纯乙醇或纯二甲基亚砜中，形成0.01～0.1g/mlDiI溶液； 

将DiI溶液加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，DiI溶液迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液上，析出粒径3-10微米 的DiI显微颗粒。 

将DiI溶液分次加入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，一次加入1-5微升。 

将DiI溶液装入玻璃微电极中，将玻璃微电极的尖端伸入人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液中，使用微量注射仪脉冲式一次推入1-5微升DiI溶液。 

玻璃微电极的尖端内径为50-200微米。 

为了实现上述目的，本发明一种DiI显微颗粒标记神经元的方法采用如下技术方案： 

一种DiI显微颗粒标记神经元的方法包括以下步骤： 

1)DiI显微颗粒制作 

在固定于载玻片上的脑片上滴加人工脑脊液或0.1mol/L磷酸盐缓冲液，形成人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层；然后，将0.01～0.1g/ml DiI溶液加入人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层中；DiI溶液会迅速以薄膜形式漂浮于人工脑脊液层或0.1mol/L磷酸盐缓冲液层上，析出粒径3-10微米的DiI显微颗粒； 

2)DiI显微颗粒埋入