[发明专利]制备细胞毒性淋巴细胞的方法

说明书

本申请是申请日为2003年3月25日，申请号为200910217143.7的、发明名称和本发明相同的发明专利申请的分案申请。

技术领域

本发明涉及制备可用于医疗领域的细胞毒性淋巴细胞的方法。

背景技术

生物体主要通过免疫应答保护其免受外来物质的侵害，其免疫系统由各种细胞及这些细胞产生的可溶性因子建立起来。在这些细胞当中，白细胞尤其是淋巴细胞起到关键的作用。淋巴细胞可分为两类，分别是B淋巴细胞(以下称为B细胞)和T淋巴细胞(以下称为T细胞)，两者都能特异性地识别某种抗原并作用于该抗原，以对生物体进行保护。

T细胞可细分为具有CD(集群名称)4标记的辅助T细胞(以下称为T_H)，其主要辅助抗体的生产和诱导各种免疫应答；和具有CD8标记的细胞毒性T细胞(T_c：细胞毒性T淋巴细胞，也称为杀伤T细胞，以下简称CTL)，其主要具有细胞毒性活性。CTL在肿瘤细胞、病毒感染细胞等的识别、破坏和消除方面发挥着最重要的作用，但它并不象B细胞那样产生能特异性地与抗原发生发应的抗体，而是直接识别和作用于来自靶细胞的抗原(抗原肽)，所述靶细胞与存在于靶细胞细胞膜表面上的主要组织相容性复合体[MHC，在人类中也称为人白细胞抗原(HLA)]I类分子结合。此时，存在于CTL细胞膜表面上的T细胞受体(以下称为TCR)特异性地识别上述抗原肽和MHC I类分子，确定所述抗原肽是衍自自身或是衍自异身。然后已被确定衍自异身的靶细胞被CTL特异性地破坏和消除。

近年来，人们对会给患者身体造成较重负担的疗法如药物疗法和放射疗法进行了反思，而且人们对只给患者身体造成较轻负担的免疫疗法的兴趣日益提高。尤其是，人们已注意到过继免疫疗法的效果，在过继免疫疗法当中，能特异性地与目的抗原反应的CTL可在体外从衍自具有正常免疫功能的人体的淋巴细胞诱导而来，或其不经诱导即可扩增，然后被转移给患者。例如，已有人提出，在动物模型中过继免疫疗法对于病毒感染和肿瘤是一种有效的疗法[Greenberg，P.D.著，Advances in Immunology，1992年出版；Reusser P.等著，Blood，78(5)，1373-1380(1991)]。在这种疗法中，重要的是维持或增加处于CTL抗原特异性细胞毒性活性得以维持或增强的状态的细胞的数量。

在上述过继免疫疗法当中，必须使给予的细胞毒性淋巴细胞的数量达到设定数量或更高，以获得治疗效果。换句话说，可以说主要问题在于要在短时间内在体外获得上述数量的细胞。

为维持或增强CTL的抗原特异性细胞毒性活性，通常采用这样的方法，即当诱导CTL对抗原的特异性应答时，可用目的抗原进行反复刺激。然而，在这种方法中，最终获得的CTL的数量往往会减少，以至于不能获得足够数量的细胞。

用以制备能有效治疗疾病的T细胞的方法已知有例如使用高浓度的用IL-2诱导的肿瘤浸润淋巴细胞(TIL)的过继免疫疗法[N.Engl.J.Med.，316，1310-1321(1996)；Rosenberg S.A.等，N.Engl.J.Med.，319(25)，1676-1680(1988)；Ho M.等，Blood，81(8)，2093-2101(1993)]。

其次，对于抗原特异性CTL的制备，已报道用自身CMV感染成纤维细胞和Il-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.，146(8)，2795-2804(1991)]或用抗CD3单克隆抗体(抗CD3mAb)和IL-2[Riddell S.A.等，J.Immunol.Methods，128(2)，189-201(1990)]分离和扩增CMV特异性CTL克隆的方法。

此外，WO 96/06929公开了REM方法(快速扩增方法)。此REM方法是一种在短时间内扩增含有抗原特异性CTL和T_H的初级T细胞群体的方法。换句话说，此方法的特征在于，可通过增殖单独的T细胞克隆提供大量的T细胞，且通过使用抗CD3抗体、IL-2和经辐射造成其增殖能力有缺陷的PBMC(外周血单核细胞)以及Epstein-Barr病毒(以下简称EBV)感染细胞，抗原特异性CTL的数量得到提高。

此外，WO97/32970公开了改进的REM方法，该方法使用能与PBMC区别开来的能表达T细胞刺激成分的未分化哺乳动物细胞株作为饲养细胞，以减少所用的PBMC的数量。