[发明专利]一种猪圆环病毒Ⅱ型核酸疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种核酸疫苗，具体涉及一种猪圆环病毒II型核酸疫苗及其制备方法。

背景技术

猪圆环病毒(Porcine circovirus，PCV)是迄今为止发现的一种最小的动物病毒，有猪圆环病毒I型(PCV1)和猪圆环病毒II型(PCV2)两种基因型。猪是PCV2的易感动物，各种年龄、不同性别的猪都可以感染PCV2。常见的仔猪断奶后多系统衰竭综合征(Postweaning multisystemic wasting syndrome，PMWS)主要发生在哺乳期和育成期的仔猪，尤其是5～12周龄的仔猪，一般于断奶后2～3天开始发病。从发病的季节来看，一年四季均可发病，但高峰期在五月，其次是四月和六月。发病日龄随着地区的不同也存在着差异，这与独特的诱发因素、母源抗体的水平以及它的下降速度不同都有一定的关系。在疾病感染流行过程中发病率和死亡率都较低，急性发病猪群中的死亡率可达10％，在感染PCV2的猪群中常常由于并发或继发细菌或病毒感染而死亡率大大增加。PCV2具有致病性，是PMWS的主要病原，PMWS呈世界性分布，是困扰养猪业的重要疾病。PCV2感染后导致猪体的免疫抑制，从而引起继发感染，进一步加重PCV2病情，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。因此，PCV2及其所致的相关疾病引起了兽医界的高度重视，成为当前研究的热点。

PCV2为无囊膜的单股环状负链DNA病毒，属于圆环病毒科圆环病毒属。该病毒无囊膜，病毒粒子直径为14～25nm，基因组大小为1767bp或1768bp，ORF1和ORF2是最主要的读码框。ORF2大小为702bp，编码233个氨基酸，是病毒的主要结构蛋白(核衣壳蛋白)，具有良好的免疫原，产生的抗体在血清中维持时间长，是构建重组疫苗和检测的首选基因。Liu等用大肠埃希氏菌表达了ORF2融合蛋白，并证明该表达产物具有很强的免疫原性。

目前在生产中通常采用加强饲养管理、减少应激、做好其他疫病的预防等措施来控制该病的发生和流行。由于PCV2在体外细胞上增殖滴度不高，毒价测定须借助免疫过氧化物酶单层试验等，因此用全病毒来制备灭活疫苗或弱毒疫苗操作繁琐，成本高。而基因工程疫苗如DNA疫苗、亚单位疫苗及病毒活载体疫苗等将是研制PCV2疫苗的主要方向。DNA疫苗作为第3代疫苗，因其既有亚单位疫苗的安全性，又有减毒活疫苗的有效性而受到研究人员的重视，它能诱导机体产生特异性抗体和保护性免疫应答。研究人员对PCV2DNA疫苗的研究发现，单一抗原的DNA疫苗攻毒保护力较低。

许多研究表明，细胞因子能够增强机体对抗原的反应性或增强抗原的免疫原性。白细胞介素-18(Interleukin-18，IL-18)是近年来新发现的一种重要的细胞免疫调节因子，它可刺激Th1细胞高水平诱生IFN-γ、GM-CSF、IL-2等细胞因子，促进T细胞的增殖，显著增强Th1细胞和NK细胞的细胞毒作用等免疫调节功能。Muneta等于1999年首次成功克隆出了猪IL-18基因并对其序列进行了初步研究(Muneta Y，Mori Y，Shimoji Y，et al.Porcine interleukin18：cloning，characterization of the cDNA and expression with the baculovirus system[J].Cytokine，2000，12(6)：566-572.)。猪IL-18(pIL-18)是目前研究较多的细胞因子佐剂，其良好的免疫增强作用在一些基因疫苗的研究中得到证实。

早在DNA疫苗产生以前就有人把细胞因子作为佐剂与疫苗联用，但由于细胞因子在体内半衰期太短且造价昂贵，未能在传统疫苗中广泛应用。直接利用大肠杆菌表达的重组猪IL-18作佐剂，也仍有较大困难。一是由于大肠杆菌为原核表达系统，该系统表达的蛋白存在非糖基化形式和非天然状态折叠等缺陷，这使得表达的蛋白分子失去天然结构，因而对重组蛋白的活性还存在争议；二是要使猪IL-18发挥佐剂效应，就必须使它到达抗原应答部位，而体外表达的重组猪IL-18被机体转运至特定部位是极其困难的。真核表达系统则对重组蛋白可进行糖基化、折叠等修饰作用，重组蛋白在结构和生物学活性等方面更接近于天然蛋白，所以真核表达系统在研究中也被广泛使用。