[发明专利]一种用于表面固定的固相载体及其制备和应用

说明书

技术领域

本发明涉及表面化学及基因工程领域，更具体地说，涉及一种用于表面固定的固相载体，和该固相载体的制备方法，以及该固相载体的应用方法。

背景技术

DNA测序技术已广泛应用于生物学研究的各个领域，很多生物学问题都可以借助高通量DNA测序技术予以解决，而大规模平行测序平台(massively parallel DNA sequencing platform)已经发展为主流的测序技术。目前，世界上较为先进的测序仪使用的都是新的测序策略——循环芯片测序法(cyclic-array sequencing)，也可将其称为“新一代测序技术或者第二代测序技术”。

新一代测序法大多通过微乳液PCR(emulsion PCR)或桥式PCR(bridge PCR)等方法获得平行测序模板。微乳液PCR通过油包水体系形成独立反应空间，扩增之后需要重新释放回收，而桥式PCR相对操作简单，只是对固相载体要求较高。

应用于桥式PCR的固相载体是将相同的引物(核苷酸序列)通过一定的作用力固定于固相载体表面，直接在固相载体表面进行PCR反应。目前应用于固相桥式PCR的固相载体，其制备方法包括以下步骤：(1)利用浓硫酸与双氧水使得固相载体表面羟基化；(2)利用氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)使表面硅烷化；(3)利用均苯三乙酸(BTA)使固相载体表面活化；(4)通过氨基羧基作用固定寡核苷酸通过测序检测信号。由于固定效果不佳，在检测荧光信号时，只能应用激光进行激发才能收集检测到足够的信号。这种检测条件过于苛刻，不适于广泛应用。上述固相载体制备方法，存在操作繁琐，固定效果差，生产成本高等问题。

因此需要一种新的用于表面固定的固相载体及其制备方法，提高固相表面固定基团的数量和固定效率，快速简便的检测出表面固定连接物的信号，同时能够简化操作程序、降低生产成本。

发明内容

本发明的目的在于提供一种用于表面固定的固相载体及其制备方法和应用，旨在解决固相表面固定基团偏少，检测信号条件过于苛刻的问题，同时可以简化操作，降低生产成本。

为了实现本发明目的，本发明提供一种用于表面固定的固相载体，所述固相载体连接有至少一个具有活化功能的表面基团，其中，表面基团包含固定端及活性端，其分子结构式如下：

其中，固定端具有至少一个用于与固相载体结合的硅氧基。

优选的，活性端-R包含用于与表面固定连接物结合的活性功能基团，其中所述活性功能基团优选通过酰胺键与活性端-R的其它部分结合；所述表面固定连接物是指被表面固定连接后用于检测或被检测的物质，包括但不限于寡核苷酸、蛋白、抗体、探针。

优选的，活性端-R所包含的活性功能基团具有至少2个用于与表面固定连接物结合的末端基团。

优选的，活性端-R为基于树脂包埋形成的树枝状结构，连接至少2个用于与表面固定连接物结合的末端基团。

更优选的，所述用于与表面固定连接物结合的末端基团为羧基。

其中，所述固相载体可以是玻片、硅片或塑料(聚苯乙烯或聚丙烯酰胺制成)中的至少一种，其表面可以是规则的平面或不规则带有弧度的表面。

为了实现本发明目的，本发明还提供一种用于表面固定的固相载体的制备方法，所述用于表面固定的固相载体的制备方法包括以下步骤：

A.利用硅烷化试剂对固相载体表面进行末端基团修饰；

B.利用活化试剂结合末端基团，使固相载体表面带上活性功能基团；

C.对活性功能基团进行树脂包埋，形成树枝状包埋体；

D.对树枝状包埋体再次活化，得到用于表面固定的固相载体。

其中，所述步骤A包括：

A1.对固相载体进行羟基化处理，使固相载体表面携带羟基；

A2.利用硅烷化试剂与羟基结合，对固相载体表面进行末端基团修饰。

优选的，对固相载体表面进行氨基化末端基团修饰。

优选的，所述步骤B通过酰胺键将活化试剂与固相载体表面的氨基化末端基团结合。

其中，所述活化试剂包含活性功能基团。

优选的，活化试剂包含的活性功能基团为羧基末端。

优选的，当活性功能基团为羧基末端时，所述步骤C通过聚酰胺树脂对固相载体表面的羧基末端进行包埋，形成树枝状结构。

优选的，基于所述树枝状结构重复步骤B的活化处理，使固相载体连接至少2个用于与表面固定连接物结合的羧基末端。