[发明专利]表达大肠杆菌毒素蛋白mazF基因的表达盒mazF-cassette及其构建法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种定点突变、删除和引入外源基因的方法。 

背景技术

枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis是一类好氧型杆状细菌，在极端条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子，广泛存在于土壤、湖泊、海洋等，自身没有致病性，只具有单层细胞外膜，能将许多蛋白质直接分泌到培养基中。枯草芽孢杆菌为芽孢杆菌中的第一个基因工程表达菌，广泛用于工业酶的生产，因此B.subtilis作为表达菌株受到越来越多的关注。 

枯草芽孢杆菌表达系统的载体主要有自主复制质粒、整合质粒和噬菌体三种。根据复制方式不同，质粒载体可分为两大类，滚环型复制和θ型复制。来源于金色葡萄球菌等革兰氏阳性菌的质粒进行滚环复制，复制时产生大量单链DNA(ssDNA)，使质粒容易产生丢失。而利用θ型复制的质粒，一般分子量比较大，在宿主菌的拷贝数比较低(通常是1-10拷贝/每个染色体)，因此能够相对稳定地中遗传。避免芽孢杆菌质粒不稳定的有效途径之一是使用整合型载体。 

迄今为止，枯草杆菌168基因组全序列中仍有超过30％的基因功能未知，后基因组学的研究发展急需一些方便简捷而高效的分子生物学工具来研究和明确这些基因的功能。目前用于基因功能研究的常用方法是反向失活法，即通常同源重组敲除失活某个特定基因或基因簇来研究它们的功能。同源重组整合载体是敲除基因中最常用的载体，它可以通过与宿主菌染色体DNA之前发生单交换或双交换同源重组而完成染色体上特定基因的插入失活和定点突变等目标，也可实现外源基因的插入和染色体大片段的删除等遗传操作。而通常情况下，抗生素抗性基因常作为正筛选标记，即菌株获得抗生素抗性。然而，修饰过的菌株中标记基因的存在给菌株的后续研究带来了许多不便，存在以下缺点：一、目前可以作为枯草芽孢杆菌筛选基因进行遗传操作的标记基因非常有限，当某一菌株已存在某一选择标记基因时，该标记基因在随后的遗传操作中就不能再作为选择标记，必需使该抗生 素基因缺失或更换其它抗性基因；二、在一个菌株中引入过多抗生素抗生基因往往会对菌株的一些生理状态产生不利影响，如影响邻近基因的表达等。此外，对于转基因微生物食品安全性的评价研究，抗生素标记基因的存在增加了转基因微生物及饲料添加剂对人类健康的潜在危险，使之安全性评价的研究更为复杂。因此，对芽孢杆菌进行无标记的遗传操作，对芽孢杆菌基因功能研究的进一步发展和转基因芽孢杆菌安全具有重大意义。 

目前，获得无标记基因的遗传操作方法主要是剔除策略，主要包括基于位点特异重组法和基于特定基因的反向筛选法。 

位点特异重组法是将标记基因置于特定重组位点之间，通过相应的特异识别该位点的重组酶催化，产生特异重组或特异切除，利用此特性可将标记基因剔除。目前微生物主要有五类位点特异重组系统，即细菌噬菌体P1的Cre-loxP系统、酵母质粒FLP-FRT系统、Zygosaccharomyces rouxli的R/RS系统、Mu噬菌体的Gin-gix重组酶系统以及λ噬菌体aatB-P系统。利用Cre-loxP或酵母质粒FLP-FRT系统切除标记基因已有大量报道(Datsenko et al.2000；Yan et al.2008；崔文涛et al.2008；Fontaine et al.2010；胡海红et al.2010；Bryan et al.2011)。此外，有学者利用了I-Sce I核酸内切酶识别特定的18bp的序列而实现标记基因的剔除(Kolisnychenko et al.2002；Posfai et al.2006)。然而，采用上述方法的缺点是，在重组位点均会残留特定的外源非天然的小序列。 

基于特定基因的反向筛选法，是将可控诱导表达一般会抑制宿主菌的生长或产生毒性，因此在添加诱导物的选择性平板上，只有那些发生了第二次单交换将抗生素基因和反向筛选标记基因删除的菌株才可以生长并形成菌落从而被筛选出来。目前最常用的反向筛选标记基因有SacB、upp、blaI和araR基因等(Fabret et al.2002；Brans et al.2004；Hashimoto et al.2005；Liu et al.2008)。 

然而，上述方法有两个共同的缺陷，即必需使用染色体上某个特定基因突变的菌株作为宿主菌株，这是一个较大的限制因素：若将该方法用于其它菌株，就必需事先准备一个特定基因突变的突变型菌株；另外，要准备特定基因缺陷菌株，该菌株的遗传背景必需清楚，如已完成基因组测序的枯草杆菌168或衍生菌株。这种方法对于遗传背景不清楚的菌株则是无效的。