[发明专利]一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法

说明书

技术领域

本发明属于生物医药基因重组领域，具体涉及一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法。 

背景技术

M蛋白是PRRSV结构蛋白中最保守的蛋白，它有一个短肽段(18aa)暴露于病毒粒子表面，可能与病毒的聚集和结合有关。M蛋白聚集于粗面型内质网上，并与GP5形成异源二聚体，在病毒对肺泡巨噬细胞附着和病毒侵染过程中起重要作用。M蛋白具有很强的免疫原性，感染后10d即可激发产生可检测的抗体应答，表达的重组M蛋白可以作为血清学试验的靶抗原和亚单位疫苗，M蛋自在细胞免疫中起重要作用。CD40L具有刺激T淋巴细胞和B淋巴细胞增殖，诱导B淋巴细胞分化。此外，它还作用于抗原呈递细胞(APC)，促进CD28、B7-1和B7-2等免疫共刺激分子的表达，提高APC的抗原递呈能力，增强免疫应答反应。 

发明内容

本发明的目的是提供一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗及制备方法，用于PRRSV感染的预防及治疗。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列。 

上述猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的制备方法，包括以下步骤： 

1)采用基因重组技术将PRRSV的M基因与CD40L的cDNA基因连接形成融合基因； 

2)将融合基因克隆到原核表达载体pET30a的克隆位点上，通过IPTG诱导表达，液相色谱纯化重组融合蛋白。 

本发明的有益效果为：用重组融合蛋白的混合弗氏免疫佐剂皮下接种猪，检测特异性IgG抗体和中和抗体滴度，验证重组融合蛋白的体液免疫水平；细胞免疫是抗细胞内感染免疫的主要形式，此重组PRRSV疫苗通过将M蛋白与CD40L的融合，能刺激机体产生抗PRRSV的细胞免疫；免疫后进行攻毒实验，结果证实可以有效地抑制PRRSV感染，降低受感染的猪的死亡率；此外，该融合蛋白抗原特异性高，不会引起非特异性免疫反应，可作为预防和治疗性疫苗在临床的应用。 

附图说明

图1为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M蛋白质氨基酸序列； 

图2为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M基因核苷酸序列； 

图3为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L蛋白质氨基酸序列； 

图4为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的CD40L基因核苷酸序列； 

图5为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-CD40L融合蛋白质氨基酸序列； 

图6为本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗的M-CD40L融合基因核苷酸序列。 

具体实施方式

本发明实施例所述的一种猪繁殖与呼吸综合症病毒M蛋白与CD40L融合疫苗，是一种基因重组融合多肽，该多肽含有PRRSV的M蛋白和CD40L的主要氨基酸序列，所述M蛋白氨基酸序列如附图1所示，所述CD40L的主要氨基酸序列如附图3所示；M基因核苷酸序列如附图2所示，CD40L基因核苷酸序列如附图4所示，M-CD40L融合蛋白氨基酸序列如附图5所示，M-CD40L融合基因核苷酸序列如附图6所示。 

实施例1M基因克隆到原核表达载体pET30a 

1、设计M基因引物 

参考PRRSV的M基因序列(GenBank号：DQ379480)设计扩增PRRSV病毒的M基因引物如下，引入酶切位点为EcoR I和Xho I(用斜体表示)： 

M-F-E：GC ATGGGGTCGTCCTTAGATGA， 

M-R-X：GC TTATTTGGCATATTTGACAAG。 

2、提取PRRS病毒RNA 

Marc-145细胞感染PRRSV毒株为VR2332，48小时后(48hpi)，根据invitrogen公司的RNA提取试剂盒，从感染病毒的Marc-145细胞中提取总RNA。 

3、PRRSV的M基因的反转录及PCR