[发明专利]一种检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法

说明书

技术领域

本发明属于兽用生物制品领域中的疾病诊断技术，具体涉及一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法。 

背景技术

猪Kobu病毒是一种无包膜的正链RNA病毒，隶属于小RNA病毒科Kobu病毒属，目前公认的Kobu病毒属有四个成员，分别为Aichi病毒，牛、猪和羊Kobu病毒。Aichi病毒于1991年从一个急性胃肠炎的日本病人中分离到，而牛的Kobu病毒则于2003从日本的牛群排泄物中检测到。2007年在匈牙利猪群排泄物中分离到猪的kobu病毒，次年在匈牙利的羊排泄物中分离到羊的Kobu病毒。在正常猪群中，Kobu病毒阳性率较高，匈牙利为65％，日本为45％，而我国正常猪群中检测阳性率为30％，另有报道在泰国对急性腹泻猪群的检测时发现Kobu病毒的阳性率高达99％。 

自2010年4月至今，韩国、泰国；我国的广东、福建、广西、江西、湖北、河北和山东规模化猪场的仔猪陆续发生严重腹泻：哺乳仔猪多在出生后2-3天发生呕吐，随后发生剧烈腹泻，死亡率较高，有的地区出现腹泻后死亡率达到100％。而母猪和育肥猪无明显症状。按照流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒感染时的处理措施，基本无显著效果。临床解剖主要症状为胃肠道的严重出血。对严重腹泻仔猪采集的样本分析发现，流行性腹泻、传染性胃肠炎和轮状病毒检测阳性率较低，阳性率不足5％，而猪博卡病毒(porcine bocavirus，PBoV)和Kobu病毒检测阳性率达到86.6％。由此可见，PBoV和Kobu病毒是这次仔猪腹泻的罪魁祸首。但到目前为止，由于对该两种病毒的认识还不够深入，尚无有效的疫苗和防治措施以及商业化的检测试剂盒问世，因此研制Kobu病毒检测试剂盒能对该病进行快速诊断，对临床治疗和疾病控制有巨大的意义。 

环介导的等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是 由T.Notomi于2000年发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异性的引物针对目的序列的四个区域进行扩增，所运用的DNA聚合酶具有链置换功能，因此可以实现恒温扩增。由于其扩增依赖于目的序列的四个特异性区域，因此其特异性和敏感性均较普通PCR和荧光定量PCR高，而且由于该反应在恒温条件下进行，因此不需要昂贵的仪器，而使用普通的水浴锅即能进行扩增反应，另外在扩增反应可以在一个小时之内完成，所需时间短，且其反应产物易于观察，可以通过肉眼判定扩增样本是否为阳性。基于以上优点，LAMP至发明之日起，已被广泛用于病原的检测，如病毒性出血败血症、巨细胞病毒、埃博拉病毒、丙型肝炎病毒、疱疹病毒、结核杆菌、沙门氏菌、大肠杆菌、禽流感、猪流感等病毒性疾病和细菌性疾病的检测。到目前为止，未发现运用LAMP方法检测Kobu病毒的报道。 

发明内容

本发明的目的是一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒及其制备方法，可以高效快速的对猪Kobu病毒进行检测，且检测手段简单，不需要昂贵的实验仪器，适合在临床疾病诊断中推广。 

本发明的目的是通过以下技术方案来实现： 

一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒，其包含以下组分： 

RT-LAMP反应试剂：该试剂运用无菌双蒸水配制，每个反应加入24μLLAMP反应液，其中LAMP反应液24μL包含的组分及浓度分别为：10U的BstDNA聚合酶，2.5μL的聚合酶缓冲液(200mM Tris-HCl(pH 8.8)，100mM KCl，100mM(NH₄)₂SO₄，1％Triton X-100)，10U AMV反转率酶，150mmol的MgSO₄，25mmol的甜菜碱，30mmol的dNTP，4.5pmol的引物P1，4.5pmol的引物P2，45pmol的引物P3，45pmol的引物P4，其中各引物序列分别为： 

P1：TGCCTTCCGCATTGTTGAG， 

P2：GGAAAAGTCAGGGTGTTGGA， 

P3：CATGGCGCGAGTGCCGTATGCTCGAACGTCTCACTGGAGA， 

P4：CCGTCTGGATGCGTTGGCACAGAGCGGAGAGGACACAA。 

一种用于检测猪Kobu病毒的RT-LAMP试剂盒的制备方法，包括以下步骤：