[发明专利]一种人神经生长因子的重组变异体及其制备方法

说明书

人神经生长因子(hNGF)是人体中一种对神经修复机能有调节作用的生物活性因子，对促进神经系统的生长，损伤神经的再生具有决定性作用。目前hNGF作为药品国内外均未上市，只有我国批准了鼠源NGF临床应用，但鼠源NGF因种属差异及病毒污染的威胁而终将被重组产品替代。用基因工程生产重组人神经生长因子是唯一的途径。rhNGF具有重要临床价值，将填补国际神经修复药物的空白。我国每年有上百万神经损伤病人，市场前景可观。

我们发明了一种通过蛋白质工程改造获得的hNGF重组变异体及其制备方法。天然活性的人神经生长因子末端为Ser-Ser-Ser-Arg-Pro-Ile-Phe-His-Arg-Gly-Glu-Phe-Ser-Val-Cys-Asn-Ser等。我们通过对其分子结构的深入研究，提出了hNGF重组变异体的新结构，此重组变异体(rhNGF)的特征在于重组表达的hNGF肽段从N端第一个氨基酸开始少了S丝氨酸、S丝氨酸、S丝氨酸、H组氨酸、P脯氨酸、I异亮氨酸、F苯丙氨酸、H组氨酸、R精氨酸、G甘氨酸等10个氨基酸，多了G甘氨酸、A丙氨酸二个氨基酸，并从E谷氨酸、F苯丙氨酸、S丝氨酸、V缬氨酸及往后氨基酸开始符合hNGF正常序列，从总体分子量上看少了8个氨基酸。我们通过上述对hNGF进行的蛋白质工程改造以期获得药效更好、更稳定的hNGF重组突变体(rhNGF)，其为具有新结构的生物分子，以利于新药开发和临床应用。

实例说明：

1.目的基因的获得

为了获得人NGF重组变异体的cDNA，我们采用全基因合成的方法获得rhNGF的cDNA。

全基因合成采用分段合成的方法进行。基因序列设计则根据我们的分子设计和参考文献报道的hNGF的基因序列。我们设计的hNGF基因序列的5’端含有Kpn1酶切位点及编码羟胺切割位点的序列，3’端含有Xba1酶切位点和终止密码TGA。合成基因设计序列见图1。

图1.rhNGF合成基因设计序列

2.基因序列测定

将人工合成的rhNGF的cDNA，插入载体pThioHis A，用合成的测序引物进行正向测序(测序仪：ABI PRISM)。

将测序图谱用计算机读序，得到cDNA序列并翻译成对应氨基酸，结果我们设计的hNGF的cDNA和氨基酸序列一致。表明我们克隆得到的rhNGF的cDNA是正确的。

3.表达质粒的构建

将rhNGF的cDNA插入pBV220中直接表达，表达产物形成不溶性的包含体，需要经过变性和复性得到有活性的rhNGF。因rhNGF含三对二硫键，复性很困难，导致产率很低。为了获得rhNGF的高效可溶性表达，我们把rhNGF与大肠杆菌硫氧还蛋白thioredoxin进行融合表达，thioredoxin可以引导其后的蛋白正确折叠，呈可溶性表达，具天然生物学活性，避免了变性复性的难题。

切割方法用的是盐酸羟胺切割法。盐酸羟胺可以特异地切割蛋白中的Asn-Gly肽键，产生N端为Gly的多肽。我们发现rhNGF多肽中不含羟胺切割位点Asn-Gly，故我们选定羟胺切割位点Asn-Gly为连接点与thioredoxin融合表达rhNGF。表达的融合蛋白用羟胺切割后释放出rhNGF，其起始氨基酸为Gly，此后的氨基酸序列与rhNGF序列一致。Gly与Met性质相似，放在N端均不影响蛋白的活性，况且hNGF的N端氨基酸对活性不重要，其N端8个氨基酸在人体内首先要被水解掉以实现功能。

羟胺是人体内的正常代谢产物，盐酸羟胺成本低，切割特异性好，切割效率高，适合工业化生产。

我们选用质粒pThioHis A作为表达载体(Invitrogen公司产品)，它含有启动子Ptrc promotor、thioredoxin前导肽及终止子aspA terminator，以及Amp抗性基因。我们将合成的rhNGF cDNA用Kpn1-Xba1双酶切后的片段插入上述质粒的Kpn1-Xba1之间，构建成表达质粒pTHNGF。

宿主菌选用大肠杆菌JM109(购自Invitrogen公司)。大肠杆菌JM109的基因型为：recA1supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thiΔ(lac-proAB)F’[traD36proAB⁺lacI^qlacZΔM15]。

将质粒pTHNGF转化入大肠杆菌JM109，即构成工程菌pTHNGF/JM109。将其保存于15％甘油中，冷冻于-70℃，即为原始种子库。