[发明专利]藤黄微球菌及其催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种产腈水解酶的微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，以及筛选获得的具有腈水解酶活性的菌株。

(二)背景技术

亚氨基二乙酸(IDA)是一种比较重要的化工原料，具有很强的络合能力能和多种金属离子络合而形成螯合物，和铜离子可以形成蓝色的鳌合物，常用作络合剂和表面活性剂，常用于有机合成，也是草甘膦(Glyphosate)生产的重要中间体。由于其分子中含有亚氨基和羧基，化学性质很活泼，广泛应用于电镀、染料、医药、电子等领域。是一种重要的化工中间体。

目前制备亚氨基二乙酸一般采用化学方法，根据原料的不同主要有氯乙酸法、氮川三乙酸法、氨代氯乙酸法、氢氰酸法、一乙醇胺法、二乙醇胺法等。传统的化学方法存在产生成本高、污染严重、对设备要求高，或者使用剧毒的氢氰酸等弱点。利用生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸与化学水解法相比，其优势在于：(1)反应条件温和。化学水解法需要在100℃左右进行，必须配备加热和温控装置，反应条件苛刻，能耗高而且对设备要求高。而生物催化法一般都是在常温下进行，反应条件温和，设备成本相对较低。(2)原料消耗大幅度减少，基本不产生可溶性盐。利用腈水解酶一步水解生成亚氨基二乙酸，省去了碱解和酸化工艺，避免了NaOH和浓盐酸的大量使用。生物法中利用NH₄OH调节转化体系的pH值，在产物回收中采用再生技术，可以有效减少可溶性盐的排放。(3)废水排放少。按照目前的化学水解工艺，生产每吨亚氨基二乙酸将至少产生废水8吨。采用生物法后，以腈水解酶酶活力10万单位计算(回用5次)，生产每吨亚氨基二乙酸的废水量可控制在2吨以下，且废水中不存在盐类等难处理杂质，可生化性强。

利用腈转化酶生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸，可以克服化学法生产亚氨基二乙酸的缺陷。生物催化是迄今为止人类所知道的最高效、最具选择性的催化体系，可以提供许多传统化学方法不能或者不易合成得到的手性化合物的合成方法，显示出优良的化学选择性、区域选择性和立体选择性。而且，生物转化反应条件温和、反应产物纯度高、容易分离和纯化，在农药中间体的生产中，显示出巨大的发展潜力。

(三)发明内容

本发明目的是微生物产酶培养得到腈水解酶催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸的制备方法。本发明所另一目的是提供筛选得到的产腈水解酶的微生物。

本发明采用的技术方案是：

藤黄微球菌(Micrococcus luteus)ZJB09131，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国.武汉.武汉大学，430072，保藏编号CCTCC No：M 209051，保藏日期2009年3月18日。

上述菌株由浙江工业大学生物工程研究所从土壤中分离获得。

本发明还涉及利用前述菌株微生物催化亚氨基二乙腈制备亚氨基二乙酸的方法，所述的方法是利用产腈水解酶的菌株，经产酶培养得到腈水解酶，以该酶为生物催化剂催化亚氨基二乙腈制备得到亚氨基二乙酸。生物催化亚氨基二乙腈生产亚氨基二乙酸的过程如下：

本发明所述的制备亚氨基二乙酸的方法具体如下：

(A)将所述藤黄微球菌CCTCC No：M 209051接种至产酶培养基，加入诱导剂a于100～200r/min、20～35℃条件下进行发酵培养2～5d；所述诱导剂a为正丁腈、异丁腈或己内酰胺；所述产酶培养基终浓度组成为：甘油8g/L，酵母膏6g/L，NaCl 1g/L，K₂HPO₄ 5g/L，MgSO₄ 0.2g/L，溶剂为水，pH值7.0；所述诱导剂a的终浓度为5g/L；

(B)取亚氨基二乙腈配制成质量浓度0.5％～6％的水溶液，调初始pH为7.0～7.5，作为酶催化反应底物溶液；以步骤(A)发酵获得的湿菌体、细胞破碎获得的粗酶液或经固定化得到的固定化细胞作为酶源，酶源加入量以湿菌体计为0.1～10g湿菌体/10mL底物溶液；控制反应温度为30℃、反应pH为6.0～9.0，进行转化反应8～16h，反应结束后，反应液经分离纯化得到亚氨基二乙酸。

上述步骤(A)所述的发酵培养优选在30℃条件下进行发酵培养3d；步骤(B)所述的控制反应温度优选为30℃，进行转化反应10h。

本发明所述的产腈水解酶的微生物由如下方法筛选获得，所述方法包括初筛和复筛：