[发明专利]禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒

说明书

 

技术领域

本发明涉及一种试剂盒，尤其是一种禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒。 

背景技术

禽卡氏杆菌病是近年来新发现的蛋鸡的一种传染病，是由卡氏杆菌（Gallibacterium anatis）引起蛋鸡群的一种产蛋量下降的疾病，临床上以输卵管囊肿和卵巢炎等为主要特征。卡氏杆菌不仅是禽卡氏杆菌病的病原，而且还能够引起其他多种禽类患病。卡氏杆菌常与鸡减蛋综合征病毒、鸡传染性支气管炎病毒、霉形体、禽肺病毒等病原混合感染，使病情加重和复杂化，给养禽业带来了巨大的经济损失。有些观点认为，该菌是鸡和其他禽类上呼吸道正常菌群，但是有报道显示在不同生物安全系统中检测鸡群的带菌状态，有些鸡为阴性。至于该菌如何从上呼吸道突破屏障变为系统感染以及该菌对正常鸡的健康状况照成何种影响，现在还没有阐明。最简单的描述，该菌是带有荚膜的，非运动的细菌，同时大部分菌株具有溶血活性。溶血素是该菌一种重要的毒力因子，现在缺少一种能对临床样品中的禽卡氏杆菌病溶血素毒力基因进行简便、快捷、灵敏、准确的试剂盒。

发明内容

本发明的目的是：提供一种禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒，它可以快速检测到分离到的禽卡氏杆菌是否含有溶血素这个重要的毒力基因，并且简便、灵敏、准备。

本发明是这样实现的：禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒，它包括500μl浓度为25 mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE缓冲液，50μlPCR酶，200μl超纯水，30μl的Marker DL2000，50μl等体积混合的引物P1，P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，30μl的阴性对照以及30μl的阳性对照。

裂解液为由Tris-base 50mM，EDTA 2 mM，pH为8.0，以及占裂解液总体积5%的triton X-100组成的混合溶液。

PCR酶的组分包括10mM的Tris-base，50mM的KCl、3mM的MgCl₂、25mM的dNTP Mixture以及0.5U的Taq DNA polymerase/μl。

引物P1，P2的序列分别为：

阴性对照为去离子水；

阳性对照为重组PMD18-T-gtxA质粒。

PCR方法的建立

PCR体系在25μl反应体系中最佳反应条件为，退火温度60°C，Taq DNA polymerase 1 U，引物浓度10μM，用引物均有效扩增出了其目的片段，片段大小为1165bp。无非特异性片段产生（见图1）。结果表明禽卡氏杆菌溶血素基因PCR检测方法建立成功。

敏感性试验

在PCR反应中，10CFU/ml～1×10⁸ CFU/ml稀释的卡氏杆菌进行PCR，卡氏杆菌溶血素基因的最低检测量为100 CFU（见图2）。结果表明建立的PCR敏感性高。

特异性试验

以禽卡氏杆菌、猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌进行PCR反应。禽卡氏杆菌为阳性，而猪链球菌、多杀性巴氏杆菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的扩增结果均为阴性（见图3）。

应用建立的PCR方法，重复检测卡氏杆菌 DNA样品3次，结果均一致。

从实验结果可以知道禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒能够对临床中禽卡氏杆菌溶血素基因进行快捷、灵敏、准确的检测。

由于采用了上述技术方案，本发明通过对PCR反应条件进行优化，研制了检测禽卡氏杆菌溶血素基因PCR试剂盒，通过PCR检测结果与阴性对照及阳性对照比较，可以得到检测结论，从而起到快速检测分离到的禽卡氏杆菌是否溶血素基因的目的。本发明检测结果准确，并且快捷、灵敏，检测方式简单，使用效果好。

附图说明

附图1为禽卡氏杆菌溶血素基因PCR试验图；M：DL2000；1：禽卡氏杆菌溶血素基因PCR结果。

附图2为禽卡氏杆菌溶血素基因PCR敏感性试验图；M：DL2000；1～8：1×10⁸ CFU/ml～10CFU/ml稀释的禽卡氏杆菌溶血素基因PCR结果。

附图3为PCR特异性试验图；M：DL2000；1：溶血素阳性的禽卡氏杆菌PCR产物；2：溶血素阴性的禽卡氏杆菌PCR产物；3：猪链球菌PCR产物；4：多杀性巴氏杆菌PCR产物；5：鼠伤寒沙门氏菌PCR产物；6：大肠杆菌PCR产物。

具体实施方式

本发明的实施例：禽卡氏杆菌溶血素基因PCR诊断试剂盒，它包括500μl浓度为25 mg/ml的蛋白酶K，1500μl裂解液，2000μlTE缓冲液，TE缓冲液的具体组成成分为Tris-base 50mM，EDTA 2 mM，pH为8.0；50μlPCR酶，PCR酶为自配的PCR预混液，其具体成分为10mM的Tris-base，50mM的KCl、3mM的MgCl₂、25mM的dNTP Mixture以及0.5U的Taq DNA polymerase/μl ；200μl超纯水，30μl的Marker DL2000，50μl等体积混合的引物P1，P2，引物P1、P2的浓度均为20μM，30μl的阴性对照以及30μl的阳性对照。