[发明专利]锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种锌指核酸酶定点敲除Myostatin基因特异靶位点。

背景技术

传统的基因敲除技术是以Cre/LoxP系统为基础，通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点，以达到定点修饰改造染色体上某一基因的目的的一种技术。目前为止，虽然利用此技术已成功制备出多种基因敲除动物模型，但实验工作量大、周期时间长、成功率低等缺点一直制约着传统基因敲除技术应用。传统基因敲除的效率约为万分之一，甚至更低。

锌指核酸酶(Zinc Finger Nuclease，ZFN)是一种由锌指蛋白和FokI核酸内切酶的剪切结构域重组形成的嵌合蛋白，其中锌指蛋白可特异性结合目的靶序列，FokI核酸内切酶则负责对DNA序列进行特异性剪切。当两个ZFN分别结合到位于DNA的双链上间隔5至7个碱基的目的靶序列后，可形成二聚体，进而激活FokI核酸内切酶的功能，使DNA在特定位点产生双链断裂，再通过同源重组或非同源末端连接修复断裂双链。ZFN能够对靶基因进行定点断裂，显著提高同源重组效率，是一种高效的新型基因打靶技术，已应用于多种动植物的基因靶向敲除。

ZFN技术不仅在生物医学研究中应用广泛，更因其不需向基因组中引入外源序列而在临床医学和农业等领域产生重要影响，提供合适靶位点，可合成出作用靶位点的表达锌指核酸酶的质粒。

猪MSTN(Myostatin)基因对骨骼肌的生长具有负调控作用。因此，对于定点敲除MSTN基因的研究成为研究的热点。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种DNA分子。

本发明提供的DNA分子，为如下(1)或(2)或(3)的DNA分子：

(1)序列表中序列1所示的DNA分子；

(2)在严格条件下与(1)限定的DNA序列杂交且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子；

(3)与(1)限定的DNA序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且编码具有相同功能相关蛋白的DNA分子。

所述严格条件为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

序列表中的序列1由32个核苷酸组成。

含有所述DNA分子的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

所述的DNA分子、所述的重组载体在抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失中的应用也是本发明保护的范围。

含有所述DNA分子的表达锌指核酸酶的质粒在抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失中的应用也是本发明保护的范围。

所述MSTN的核苷酸序列为序列表中的序列4。

所述抑制MSTN基因表达或导致MSTN功能丧失通过改变MSTN的编码框体现。

所述改变MSTN的编码框体现在MSTN编码框的定点敲除、突变和/或定点插入。

本发明的实验证明，本发明定位了MSTN基因中一段特异的靶序列位点DNA片段，并针对此特异位点构建ZFN质粒，将此质粒核转染猪胎儿成纤维细胞可以定点敲除或突变MSTN基因中特异的靶序列，并彻底破坏MSTN基因的表达。本发明的显著优势表现在针对MSTN序列中特异的靶序列位点构建的ZFN质粒可以按照设计人员的需求精确定点敲除或突变猪胎儿成纤维细胞中MSTN基因的靶位点序列，基因敲除效率高，能大大提高研究效率，能为研究MSTN基因的功能、制备定点敲除或突变MSTN转基因猪提供保证。

附图说明

图1为ZFN的特异结合位点和特异敲除靶位点序列

图2为ZFN定点敲除MSTN基因载体图

图3为ZFN定点敲除MSTN特异位点原理图

图4为菌液PCR鉴定图

图5为阳性克隆定点敲除、突变和插入测序结果图

具体实施方式

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1、针对猪MSTN基因特异靶位点序列ZFN质粒的设计与构建

1、针对猪MSTN基因特异靶位点序列的设计