[发明专利]一种用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体（Wolbachia）的提取方法

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的提取方法。 

背景技术：

沃尔巴克氏体(Wolbachia)是广泛分布于节肢动物体内的共生微生物，它可能是昆虫共生微生物中最为丰富的类群。它分布于鞘翅目、双翅目、半翅目、同翅目、膜翅目、鳞翅目等昆虫种类中。它以垂直传播作为其在宿主世代间传递的基本模式。它稳定地存在于宿主的生殖细胞内，通过卵细胞传递给宿主子代，并可通过多种方式如细胞质不亲和、雌性化和杀雄性等调控宿主的生殖活动。通过这些调控作用促进其在宿主种群内广泛传播。 

在沃尔巴克氏体(Wolbachia)引起的宿主生殖行为改变中，细胞质不亲和(Cytoplasmic Incompatibility，CI)是最常见的一种类型。它表现为当被沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染的雄蚊与未感染雌蚊或感染不同种类Wolbachia的雌雄蚊交配时，精子和卵子结合后胚胎无法发育。沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胞质不亲和的特性可导致Wolbachia感染的蚊能侵入未感染或感染不同种Wolbachia的蚊群进行种群压制和种群替代。它的应用对蚊媒病防治具有巨大的价值。 

它的具体应用依赖于在病媒蚊群中人工引入沃尔巴克氏体(Wolbachia)感染。一些医学上重要的传播疾病蚊种如按蚊(传播疟疾)和伊蚊(传播登革)天然都不感染沃尔巴克氏体(Wolbachia)。所以建立人工用沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染蚊子的方法显得十分重要。目前，主要采用胚胎注射的方法转染蚊子。此方法大致过程为：获取沃尔巴克氏体 (Wolbachia)；胚胎注射和转染成功蚊株的筛选。因此首先必须获得纯化的沃尔巴克氏体(Wolbachia)。现阶段，有二种方法获取沃尔巴克氏体(Wolbachia)：一种是先采用人工强制蚊子或果蝇产卵的方法收集含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎，再从中直接抽取胞浆；另一种是先从含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)组织中提取沃尔巴克氏体(Wolbachia)，把它转入细胞内，让它在细胞内生长一段时间(1-2年)后，再提取它用于转染蚊子。对于第一种方法，沃尔巴克氏体(Wolbachia)的获取依赖于人工强制产卵的方法收集的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎，而人工强制产卵的方法可控性很差。大多数情况下，不能有效地在需要的时间内(胚胎注射需在蚊卵不超过排出后1.5小时左右完成注射，以便沃尔巴克氏体进入生殖细胞；超过排出后1.5小时的卵一般不能用于胚胎注射)获取用于抽取沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎。所以，大量时间和精力会消耗在规定时间人工强制产卵的方法获取含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的胚胎上。而第二种耗时太长，不利于快速建立沃尔巴克氏体(Wolbachia)转染的蚊株。 

发明内容：

本发明的目的是提供一种可控性极强，操作方便，非常容易在规定的时间内获取大量用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的提取方法。 

本发明的用于胚胎注射转染的沃尔巴克氏体(Wolbachia)的提取方法，其特征在于，包括以下步骤： 

(1)：昆虫卵巢的制备：解剖含有沃尔巴克氏体的昆虫，获得其卵巢，置于SPG缓冲液中； 

(2)：将卵巢匀浆，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心100g～1000g， 1min～10min，取上清再离心5000g～15000g，5～20min，去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心100g～1000g，1min～10min，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体，该纯化的沃尔巴克氏体即可用于蚊子的胚胎注射。 

所述的含有沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫包括天然或人工感染沃尔巴克氏体(Wolbachia)的昆虫，优选为天然或人工感染沃尔巴克氏体(Wolbachia)的蚊子和果蝇。 

优选，所述的沃尔巴克氏体的获取中步骤(2)为：将卵巢匀浆，用SPG缓冲液冲洗收集，然后置于离心机中离心，300g，5min，取上清再离心12000g，10min，去除上清，沉积物再用SPG缓冲液冲悬，再离心300g，5min，取上清，即得到纯化的沃尔巴克氏体。