[发明专利]一种快速获得辣椒转基因植株的方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域中转基因植株的获取方法，尤其涉及一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。

背景技术

转基因技术是利用重组DNA、细胞组织培养或种质系统转化等技术，将外源基因导入植物细胞或组织，使之定向重组遗传物质，改良植物性状，培育优质高产作物新品种。自1983年首例转基因植株诞生，天然植物基因工程开始在人工控制下定向改良植物的遗传性状。与常规育种方法相比，它具有以下一些特点：1）不受亲缘关系的限制，可实现动物、植物和微生物间遗传物质的交流，从而充分利用自然界存在的各种遗传资源；2）有效地打破有利基因和不利基因的连锁，充分利用有用基因；3）加快育种进程，缩短育种年限。

自第一例转基因烟草问世以来，植物转基因研究和应用发展迅速。到1997年为止，全世界转基因植物涉及到至少35科的200多个种。目前，植株转基因已成为植物分子生物学研究的强有力的实验手段；更是基因克隆、功能基因组研究必不可少的实验工具。近年来，遗传转化方法不断创新，已发表的植物转基因操作体系有近10种，以转化系统的原理大致可分为三类：1）农杆菌介导的基因转移；2）以原生质体、细胞或组织为受体的直接转移，如电激、微注射、PEG介导法；3）种质系统的基因转移，如利用子房注射、种胚、体细胞胚及花粉。目前应用最多的是根癌农杆菌介导的转基因方法，迄今所获得的200多种转基因植物中，80%以上是利用该方法获得的。截至1999年，至少30个国家进行了总计3万次以上的转基因作物的田间试验，改良的经济性状有10多个；已有大豆、玉米、棉花、油菜、番茄、马铃薯、烟草、西葫芦和蕃木瓜等9种作物的转基因品种投入了商业化生产，取得了良好的社会效益和经济效益。

辣椒为茄科辣椒属蔬菜作物，是我国栽培面积最大的蔬菜作物之一。自从首次开展辣椒组织培养工作以来，国内外相继出现采用不同的辣椒外植体，如子叶、茎尖、茎段、叶片、下胚轴、子叶柄、花药及其原生质体等进行组织培养的报道。但辣椒组织培养具有很强的基因型特异性，再生效率不理想，在多数试验中植株的再生周期长或分化频率低，其不定芽的生长能力较差，有的甚至停留在芽诱导阶段而不能进一步生长，这在很大程度上限制了辣椒基因工程的研究进展。目前，关于辣椒转基因工作研究主要集中遗传转化体系的建立上，但遗传转化过程仍存在一些主要问题限制了辣椒转基因技术在实际育种中的应用，如：培养周期长、植株再生困难和遗传转化率低等。因此，如何建立成熟的遗传转化体系、提高遗传转化率是辣椒转基因工作中急需解决的一个难题。

发明内容

技术问题  本发明的目的是提供一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。该方法可用于新基因功能的验证以及优良转基因育种材料的获得，也为其他作物的转基因研究提供参考。

技术方案  本发明提供了一种通过农杆菌侵染辣椒未成熟胚快速获得转基因植株的方法。其过程是对辣椒未成熟胚先进行农杆菌侵染，再进行培养，然后对获得的再生植株进行PCR鉴定，在短期内获得转基因植株。具体步骤如下：

1）取样：在果实采摘期晴天从健壮植株上取自然成熟的红果（授粉后40~50天）。

2）农杆菌活化和侵染：将含有目的基因（掌叶半夏凝集素基因PPA，基因全长777bp）的农杆菌LBA4404接种于含有45mg/L卡那霉素及50mg/L利福平的YEB的固体培养基上，27℃暗培养2d后，挑单菌落接种至含有45mg/L卡那霉素及45mg/L利福平的YEB液体培养基中，27℃，250rpm振荡培养至OD₆₀₀值为0.4~06，将菌液转入50mL离心管中，4000rpm离心菌液后，用等体积的无菌水悬浮菌液后备用。取1）中果实的种子，用解剖刀将其一分为二，随后取出未成熟胚转移至已准备好的农杆菌菌液中，浸没5分钟。

3）再生培养基（R培养基）和筛选培养基（S培养基）制备：R和S培养基所用基本培养基为MS培养基，所用碳源为蔗糖，凝固剂为琼脂。R培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂，S培养基的组成成分为MS+2mg/L 6-BA+3%蔗糖+0.8%琼脂+60mg/L卡那霉素。

4）未成熟胚接种和培养：将2）中侵染的未成熟胚在灭菌滤纸上沥干菌液后，置于3）中R培养基上培养先在27℃黑暗条件下培养3天后用无菌水冲洗数次外植体，转移到筛选培养基上，黑暗培养1周，后于光照度2000lx、光照时间12h、室温27℃下继续培养，每三角瓶放30个未成熟胚。