[发明专利]水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用

说明书

技术领域

本发明属于医疗器械技术领域，特别是涉及水蛭素在特定条件下失活后检测凝血四项方面的应用。

背景技术

中华人民共和国《中国药典》2010年版，第一部记载“水蛭（HIRUDO）”，本品为水蛭科动物蚂蟥Whitmania pigra Whitman、水蛭Hirudo nipponica Whitman或柳叶蚂蟥Whitmania wranulata Whitman的干燥全体，夏、秋二季捕捉，用沸水烫死，晒干或低湿干燥。炮制：水蛭洗净、切段、干燥。烫水蛭：取净水蛭段，照烫法用滑石粉浇至微鼓起。功能与主治：破血，逐瘀，通经。用于血瘀经闭，跌扑损伤。

国外医学输血及血液分册1993年第16卷第6期记载中国医学科学院血液研究所，郭娟综述 王荷碧 审校“重组水蛭素的研究进展”Haycraft于1884年发现医用水蛭提取物中有抗凝物质。50年代末，Markwardt首次分离出纯品，命名为水蛭素（Hirudin）,并知其为凝血酶特异抑制剂，是一种理想的抗凝、抗血栓制剂。80年代初得知其结构和氨基酸顺序。因天然水蛭素提取步骤繁琐，且饲养水蛭困难，水蛭来源匮乏，难于得到足够量的纯品，使研究与临床应用受到限制。近年来，基因工程技术的发展弥补了这一缺陷，利用化学合成、cDNA文库、PCR方法获得基因克隆，表达获得重组水蛭素，从而较深入地研究了水蛭素的药理学、药效学和毒性等，大量动物实验及临床试用，加快了水蛭素应用于临床的进程。

水蛭素的结构：天然水蛭素是不含多糖，由65或66个氨基酸残基组成的单链蛋白，分子量约7，000，富含二羧基氨基酸，无Arg、Met和Trp,有三个分子内二硫键位于肽链N-端，对分子构型起稳定作用；C-端有较多的酸性氨基酸残基，且有一硫酸化Tyr;肽链中部有一个由Pro-Lys⁴⁷-Pro组成的特殊结构，其在水蛭素与凝血酶相互作用中起一定的作用。

     水蛭素在干燥状态下稳定，室温下可稳定保存6个月以上，80℃下15分钟不被破坏。pH升高(或下降)则稳定性下降。在0.1mol/L NaOH或0.1mol/L HCl可稳定存在15分钟。胰蛋白酶和α-糜蛋白酶不破坏水蛭素的活性。番木瓜蛋白酶、酶蛋白酶和枯草杆菌蛋白酶可使之失活。水蛭素溶于水和 0.9% NaCl溶液。不溶于乙醇、丙酮。

水蛭素抗凝原理为（国外医学输血及血液分册1993年第16卷第6期记载中国医学科学院血液研究所，郭娟综述 王荷碧 审校“重组水蛭素的研究进展”）重组水蛭素与ɑ-凝血酶形成稳定特异的复合物，此时凝血酶全部蛋白酶水解功能被封闭，故水蛭素不仅能防止纤维蛋白原的凝固作用，而且能阻断凝血酶催化的止血反应，诸如因子Ⅴ、Ⅷ及ⅩⅢ的激活，凝血酶诱发的血小板反应，防止了凝血酶原活化的正反馈而导致的凝血酶生成。同时水蛭素不干扰凝血因子的生物合成，对抗凝血酶Ⅲ（AT-Ⅲ）亦无影响。

依水蛭素活性在血中的浓度高低比例，能在需要的时间内完全抑制血液凝固作用。凝固作用的变化如凝血酶时间（TT）、部分凝血活酶时间（APTT）及凝血酶原时间（PT），随水蛭素不同浓度而变化。

凝血酶是一种多样细胞活性的促效剂，与水蛭素复合后，它便丧失了对这些细胞的非止血效应。

水蛭素与凝血酶的特异性结合分二个阶段。首先，水蛭素C末端的酸性氨基酸与凝血酶的碱性部位结合，封闭凝血酶的底物识别位点。其次，该结合使凝血酶构型发生轻微变化，使水蛭素N端与凝血酶的活性中心结合，从而抑制凝血酶的催化活性。水蛭素抗凝原理是抑制凝血四项的产生，也就是抑制纤维蛋白原形成纤维蛋白从而达到抗凝效果，但在抗凝过程中不破坏凝血因子（水蛭素为抑制凝血因子的形成）如形成一定条件下水蛭素可以被分解，那么血液中的凝血因子被完整释放后不会影响检测凝血四项的结果。