[发明专利]壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种壳聚糖流感疫苗的制备方法。

背景技术

猪流感是由正黏病毒科A型流感病毒引起的一种猪的急性、传染性呼吸道疾病，传播迅速，常引起急性呼吸道疾病暴发。因为猪流感病毒亚型较多、抗原易发生变异以及可在种间传播，给猪流感疾病的预防乃至人类的健康带来很多挑战。

DNA疫苗是将含有编码抗原基因的真核表达质粒直接接种体内，在体内表达相应抗原刺激机体产生针对该抗原的免疫应答，产生保护性免疫。目前，DNA疫苗大动物实验、人体临床实验结果表明：DNA疫苗存在着给药剂量较大，生物利用度低，免疫效果个体差异大，不够理想的缺点，极大地阻碍了DNA疫苗的研究进展。如何增强DNA疫苗的免疫效果、诱导产生粘膜免疫等课题是当前DNA疫苗研究的国际热点。目前，国外DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究发展十分迅速，取得了不少阶段性成果，有的已进入临床实验。国内DNA疫苗微球/纳米粒黏膜免疫递送系统的研究工作开展较少，尤其是猪流感DNA疫苗黏膜免疫递送系统的研究还尚未见有报道。

发明内容

本发明提供了一种壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒的制备方法。

本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒按以下步骤制备：

一、将0.1g壳聚糖溶于100mL、pH值为5.5的醋酸醋酸钠缓冲液中，然后用滤膜孔径为0.22μm滤器过滤，使用时再用pH值为5.5的醋酸醋酸钠缓冲液将滤液稀释至壳聚糖浓度为200μg/mL，得到壳聚糖溶液；

二、用步骤一制备的壳聚糖溶液和猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液分别置于55℃水浴中预热30min，然后立即用等体积的壳聚糖溶液和猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液混合，再涡旋30s，并室温静置1h，即得到壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒；

其中步骤二猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA溶液中Na₂SO₄的浓度为5mmol/L，猪流感病毒H3N2亚型HA基因重组质粒DNA的浓度为120μg/mL。

本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒具有巨大的应用潜力，本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒递送系统具有靶向作用，可对猪流感DNA疫苗具有保护作用，提高细胞转运效率，提高免疫效果并可经口服和鼻腔给药，诱导黏膜免疫等特点。因此，本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒黏膜免疫递送系统是一个很好的递送系统，将促进猪流感DNA疫苗在畜牧业和临床的实际应用，届时用于预防、治疗、诊断动物和人的疾患，将拯救诸多病畜或病者的生命或延长其寿命，其经济效益和社会效益无疑是巨大的。

经透射电子显微镜观察本发明制备的壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒形态规则、外形圆整，表面光滑、分散性好，粒径为153.0±6.2nm(如图2所示)，多分散指数为0.20。Zeta电位分析本发明制备的壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒Zeta电位为+22.5mV(如图3所示)，包封率为98.3％±1.4％，载药量为46.8％±2.3％。本发明制备的壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒经黏膜免疫大大增强了猪流感DNA疫苗的机体局部和全身的体液免疫及细胞免疫效果；同时克服了减活疫苗在储存和运输过程中易失活等缺点，且用本发明方法所制备处的壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒易于保存，稳定性高、包封率高、载药量大、毒性小、药物生物利用度高、成本低、易于工业化生产。

使用本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒在保证DNA疫苗稳定性的条件下具有较高的包封率(包封率为98.3％±1.4％)，可以保持体内最佳的药物浓度，并且延长药物作用的时间。因此，本发明方法制备的DNA疫苗纳米粒可实现药物的缓控释。

本发明方法具有工艺简便、制备成本低、工艺重现性好、样品需要量少，较好保持了DNA疫苗的活性等优点，试验筛选的壳聚糖DNA疫苗纳米粒的制备方法也可放大到生产应用，因而对产业化的应用具有指导意义。

本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒可用于猪流感免疫，经口服给药，按体重免疫注射给药，给药量为95～105μg/100μL。

附图说明

图1是具体实施方式一中猪流感DNA疫苗壳聚糖纳米粒的透射电子显微镜观察图。

图2是本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒的粒径分布图。

图3是本发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒的Zeta电位图。

图4是具体实施方式一中发明壳聚糖猪流感DNA疫苗纳米粒的琼脂糖凝胶电泳检测图。