[发明专利]新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法

权利要求书

1.新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，包括下列步骤：

（1）超声破菌：每克菌体加入10ml预冷TE 缓冲液，所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5，混匀后加入溶菌酶至菌体的浓度为1%，充分混匀，温度保持在2~8℃，作用1小时以上；超声破菌2min/次，共6次；然后在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；

（2）TE缓冲液洗涤：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron-100 TE缓冲液洗涤，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5；

（3）室温裂解：将步骤（2）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入包涵体裂解液中，搅匀，室温裂解1小时；所述包涵体裂解液为6M盐酸胍、50mM Tris-Hcl和8mM DTT中的一种或多种，所述包涵体裂解液的pH值为9.0；

（4）复性：将步骤（3）裂解后的混合溶液滴加至复性液中，稀释后的蛋白浓度为1~2mg/ml，在2~8℃的温度下搅拌48小时，再用pH9.0的10mM Tris-Hcl和1.5M尿素稀释1~5倍；

（5）调节PH和离心：用醋酸调节pH值至5.0，离心去除沉淀物，收集溶液；

（6）将溶液依次进行Protein-A Mabselect SuRe层析、SP Sepharose H.P层析和Sephacryl S-200分子筛层析。

2.根据权利要求1所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述Protein-A Mabselect SuRe层析如下进行：先用pH值为8.5的含2M脲的50mM的Tris-Hcl，平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子3~5个柱体积，上样，再用pH值为8.5的含2M脲的50mM Tris-Hcl，充分平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，然后用pH值为7.2的含20mM PBS的缓冲液平衡Protein-A Mabselect SuRe柱子2~3个柱体积，最后用pH3.0的含50mM 醋酸-醋酸钠的缓冲液洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。

3.根据权利要求1所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述SP Sepharose H.P层析如下进行：用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，充分平衡SP Sepharose H.P柱子，上样，再用pH值为5.0的含100mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡柱子，然后用pH值为5.0的含210mM NaCl的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱杂质，最后用pH值为5.0的含300mM NaCl的20mM 醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱目的蛋白，收集洗脱峰。

4.根据权利要求1所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（6）中的所述Sephacryl S-200分子筛层析如下进行：用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液，平衡Sephacryl S-200分子筛柱子3-5个柱体积，上样，上样量为柱床体积的1~5%，用pH值为5.0的20mM醋酸-醋酸钠缓冲液平衡，收集目的蛋白峰。

5.根据权利要求4所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，在所述Sephacryl S-200分子筛层析中，所述上样量为柱床体积的3%。

6.根据权利要求1所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（2）为：将步骤（1）收集的沉淀物按1:10（重量/体积）加入含0.5% tritron-100 TE缓冲液洗涤，在2~8℃温度下以8500转/分钟的速度离心15分钟，收集沉淀；再重复此步骤，收集沉淀；所述缓冲液为50mM Tris-Hcl和/或5mM EDTA，所述缓冲液的pH值为8.5。

7.根据权利要求1—6任一项所述的新型血小板生成素拟肽复性和纯化方法，其特征在于，所述步骤（4）中，所述稀释后的蛋白浓度为1.5mg/ml，和/或用pH9.0的10mM Tris-Hcl和1.5M尿素稀释3倍。