[发明专利]扩增马传染性贫血病毒主要经典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物组

说明书

技术领域

本发明涉及马传染性贫血病毒的检测引物，尤其涉及基于nest-PCR设计的检测马传染性贫血病毒主要经典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物组，及其检测方法和应用，属于马传染性贫血病毒的检测领域。

背景技术

马传染性贫血病毒(Equine infectious anemia virus，EIAV)属反转录病毒科慢病毒属成员，是严重危害马属动物的传染病-马传染性贫血病(Equine infectious anemia，EIA)的病原体。

Gp90基因是编码EIAV囊膜蛋白Gp90的病毒基因，全长约1.4kb。囊膜蛋白Gp90，作为配体与宿主细胞受体ELR相互作用，帮助病毒进入宿主细胞。由于慢病毒的反转录酶忠实性差，使慢病毒在复制时会产生高频率基因突变，导致病毒抗原持续漂移。无论是不同EIAV毒株间，亦或由同一毒株体内进化出的不同准种间，病毒蛋白中发生突变频率最高的均为Gp90蛋白。而Gp90蛋白突变，是病毒逃逸宿主免疫监视，形成持续进化的主要原因，体外扩增EIAVgp90基因序列并对其进行序列分析，对开展EIAV分子流行病学、抗原变异分析和免疫逃逸机制等研究，均具有重要意义。

由于gp90基因的高突变和地区间进化的影响，不同EIAV毒株间具有较高水平的基因组差异。例如EIAV美洲代表株EIAVwyo与我国的EIAV_LN40基因组差异高达30％。该高变异特点，使得以某一代表株基因背景设计的用于扩增gp90基因的引物，当用于其他毒株的基因扩增时，可能并不适合。因此，若能设计不受EIAV基因多样性影响，可通用于主要EIAV代表毒株和EIAV现地流行株gp90基因扩增的引物，对于EIAV分子流行病学研究的及时、有效开展，提高监测EIAV流行和变异工作的效率，十分必要。

发明内容

针对上述问题本发明的发明人通过对EIAV主要经典毒株EIAV_wyo、EIAV_Argen、EIAV_LN40的全基因序列进行比对，并基于保守区设计扩增引物，使用分子生物学软件Oligo6.0辅助完成引物设计。

本发明所解决的技术问题之一提供了一组用于扩增马传染性贫血病毒主要经典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物组，其特征在于所述的引物组由外套引物对和内套引物对组成，所述的外套引物对序列如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示，所述内套引物对序列如SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示。

确定的nest-PCR引物组序列如下：外套引物，上游：P-EIAV-gp90-f，5′CA CCA GAG TGT TGT GGA AAG GTG A 3′(即SEQ ID No.1)，下游：

P-EIAV-gp90-r，5′GA CCC CAT GAT TCA TTC CA 3′(即SEQ ID No.2)。内套引物，上游：p-EIAV-gp90-f-1，5′TG TAA GGT TTG GTG TAT GGG 3′(即SEQ ID No.3)，下游：p-EIAV-gp90-r-1，5′TG GCA GCT ATT ATA GCA GA 3′(即SEQ ID No.4)。

本发明所解决的技术问题之二提供一种用于马传染性贫血病毒检测的方法，其特征在于：使用以上所述的引物组对待测样品进行nest-PCR扩增。

其中，所述的nest-PCR扩增反应中，优选的，外套引物对的退火温度为53℃，内套引物对的退火温度为51℃；延伸时间分别为2min和1min30sec，两次反应分别各进行35个循环。

本发明所解决的技术问题之三是提供所述的用于扩增马传染性贫血病毒主要经典毒株gp90基因的通用nest-PCR引物组在制备检测或诊断马传染性贫血病毒的生物试剂中的用途。

本研究结果表明，本发明设计的nest-PCR引物可通用于EIAV主要代表毒株gp90基因的扩增，而对于本研究使用的现地分离株的扩增结果，提示其同样具有扩增特异性。以上研究结果证明，本研究建立的nest-PCR引物，是可用于临床EIAV流行毒株分子流行病学研究、扩增gp90基因的有效通用引物。

附图说明