[发明专利]一种在线原位监测固态发酵真菌生物量的方法

说明书

技术领域

本发明专利属于固态发酵生物量的在线原位监测领域，具体指一种应用原位数字图像分析技术、结合现代化学计量学方法的非破坏性测定固态发酵真菌生物量的方法。

背景技术

测定发酵过程生产菌株的生物量变化是建立固态发酵微生物生长动力学的基础，对于研究发酵过程微生物生长控制及发酵工艺优化调控有重要的意义，因此一直成为发酵动力学研究的重要内容。固态发酵的生产菌株多为丝状真菌，发酵过程中菌丝体与基质缠绕、黏连，两者难以分离，因此固态发酵生物量不适合用直接计数法来测定。之后的研究发展出基于代谢活动或者生物体中某些特殊物质的含量推知生物量等化学方法，前者根据微生物代谢过程产生的二氧化碳量或者胞外酶的浓度来估测生物量，后者通过测定氨基葡糖、麦角固醇等细胞壁化学成分来测定，但是上述化学方法都不能避免杂质干扰、结果可比性差、无法实时在线测定等问题。尤其对于大型封闭式发酵，测定发酵不同阶段微生物的生长情况更为困难：一方面取样困难、容易感染杂菌；另一方面由于发酵基质异质性严重，所取样品代表性差，不能反映发酵整体水平。因此生物量的在线监测一直都是固态发酵的难题，这也成为固态发酵实现智能控制的阻碍因素。目前的在线监测技术中以近红外光谱分析为主，但是这种方法仍然存在造价高、监测范围小、计算模型参数需要大量数据来训练等问题，因而在固态发酵行业没有实现有效推广。因此，发展一种简便易行、能够在线原位监测固态发酵生物量的方法势在必行。

于20世纪80年代发展起来的分形学说起初用于定量描述具有某种自相似特征的不规则物体，分形维数用于表征物体不规则的程度。后来这一学说被广泛应用于各种专业，在真菌表征方面也证明了它的有效性。真菌菌丝都有不规则和自相似的特征，由于资源的数量和质量在种间换算不同，在不遭受破坏的前提下，通过图象分析其菌丝体营养系统，发现资源的数量和质量影响菌丝体延展率、外部资源的生物量生产和分布；利用分形模型对霉菌菌落的显微图像进行纹理分析，发现表面的覆盖维数是描述菌落的有效特征(罗红燕等，2009，微生物学杂质，第29卷第4期，75-77页)。上述研究表明，使用基于计算机数字图像处理所得到的菌体分形维数与菌丝体生长之间有密切的相关性，能够用于表征菌体生长特征。

另外，将分形维数同物体可定量性质相关联的研究也广泛存在。一些学者研究了分形维数同多孔介质有效导热系数之间的关系，通过回归分析得到的等效导热系数与固体颗粒分形维数的指数关系模型(李守巨等，2009，岩土力学，第30卷第5期，1465-1470页)；还有一些研究表明，粉体堆积密度、多孔体的渗透率同其分形维数之间有明确的函数关系(秦宣云等，2008，湖北民族学院学报，第26卷第2期，131-134页；罗慧等，2007，三明学院学报，第24卷第4期，396-398页)。上述函数模型都经实验证明具有较好的指导性。因此，确定具有分形特征的物质性质与其分形维数之间的函数关系非常可行，对于非破坏性地估测物质性质有良好的指导意义。

如前所述，真菌菌丝体生长具有显著的分形特征，可通过计算机数字图像处理的方法计算其分形维数；具有某种分形特征的物质性质同分形维数之间的关联可以用函数来表示。因此，将固态发酵菌体生长的分形维数同生物量相关联具有较高的可行性，能够实现基于数字图像处理的固态发酵真菌生物量无破坏性在线原位监测，但是这种方法尚未见报道。

发明内容

针对目前固态发酵过程生物量无法在线准确测定的问题，本发明专利提供一种固态发酵真菌生物量的在线原位监测方法，具体指一种应用原位数字图像分析技术、结合现代化学计量学方法的非破坏性测定固态发酵真菌生物量的方法。

本发明提供一种固态发酵真菌生物量的在线原位监测方法，包括以下步骤：

步骤一：建模样品准备

在反应器外使用生产菌株进行发酵试验，控制温度、湿度等发酵条件恒定，平行实验至少做50组；

步骤二：建模数据采集

使用高分辨率摄像头测定不同发酵阶段菌体生长图像，并通过数字图像分析方法计算图像中菌体-基质混合物的分形维数，同时使用化学法测定相应的菌体生物量；

步骤三：模型建立与优化

使用数学软件拟合分形维数和菌体生物量之间的函数关系，以所测样品集的交叉验证均方差(RMSEVC)为指标优化模型参数，选取RMSECV尽可能小的组合。RMSECV计算公式如下：