[发明专利]以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法

说明书

技术领域

本发明属于植物组织培养方法。

背景技术

滇杨（Populus yunnanensis）是杨柳科杨属青杨派树种，尚有的少量滇杨原始野生植株仅存于部分海拔较高的山区，现存滇杨林分主要以人工林为主，且基本由雄株组成，雌株极为少见。滇杨作为林木遗传育种中的模式植物，其组织培养包括基本培养基及外源激素选择，外植体选择、消毒、分化、增殖与生根培养及炼苗移栽等步骤。杨树外植体的选择上，与茎尖分生组织接连的腋芽、叶片、茎尖具有较强的形态发生能力，通常从优树上选取相应组织部分复幼后再取外植体。金顺玉等在“黑林1号杨(小黑杨×波兰15A)的组织培养与植株再生”（植物生理学通讯[J], 2003,39(6):639）中，利用叶片作为外植体，用75%乙醇消毒1min附加NaClO消毒2min获得了无菌苗。 “3个杨树品种叶片再生体系的建立”（沈周高，等.[J].中国农学通报, 2006, 22 (11):90-92.），对3种黑杨杂种叶片不同时长的消毒处理结果中，0.1%HgCl₂溶液消毒4min处理，叶片污染率为20%，出愈率为76%。经过诱导，外植体重新开始细胞分裂与器官分化，形成完整植株。

不同杨树的生长环境与生物学习性不同，导致适合其诱导、增殖及生根培养的培养基不同。例如，京2杨生长需要较高的营养，MS培养基更适于腋芽的启动和生长。（张蕾,苏晓华等.京2杨组培条件的优化及再生体系建立[J].林业科学研究, 2007, 20 (6) : 787-793）。欧美杨“山地一号”丛生芽的增殖以MH为基础培养基，用0.3-0.8mg/L浓度6-BA与0.05mg/L浓度的NAA混配（杨传平等，“欧美杨‘山地1号’组织培养再生系统的建立”[J].分子植物育种,2006,4(4): 579-582. ）。杨树的生根培养大都采用1/2MS为基础培养基，附加一定量的NAA、IAA、IBA。史绍林等诱导新西伯利亚银白杨的根，采用1/2MS+0.1 mg/LNAA +0.02 mg/LIBA作为根诱导培养基配方，生根率达90%，根数多，生长健壮。（“新西伯利亚银白杨组织培养基配方的筛选与应用”[J].防护林科技,2008,(6):25-26.）在杨树组培苗炼苗移栽过程中，韩玉琴等在“山新杨微繁工厂化配套生产技术”中选择黑土和草炭土附加少量草木灰、细沙、马粪为移栽基质（黑龙江农业科学[J],2005, (2) :59-60.）。康冰等在欧美速生杨炼苗移栽中，选用干净河沙为基质，保持温度26℃，相对湿度为85%，30d后成活率达到90%以上（“速生欧美黑杨愈伤组织诱导及植株再生”[J].植物生理学通讯, 2004, 40(5): 582.）。   

此外，光照作为杨树组织培养过程中重要的影响因子，不同强度和波长的光照将直接影响再生体系的建立。

与滇杨组织培养相关的文献中，有张春霞等以初春时采摘二年生滇杨枝条在室温下水培长出新叶，取水培新叶的叶柄消毒得到的无菌材料作为外植体，利用1/2MS基本培养基附加苯基噻二唑基脲(TDZ)、NAA等组成的三种培养基对叶柄诱导分化、增殖以及生根等进行离体再生的研究（“滇杨的组织培养和植株再生”，植物生理学通讯[J],2006,42(6):1131）。但该方法作为实验室研究，而在工业化条件下叶柄取材量大，基础培养基和外源激素要求较高，尤其是对叶柄进行的离体组织培养实验较为单一，未对不同生长因子或激素的可能组合的培养基进行对比。

发明内容

本发明目的是用滇杨离体嫩茎作为外植体进行组织培养，建立以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，为滇杨离体的工厂化快速繁殖和育苗、以及滇杨生理遗传性质研究提供方法。

本发明目的通过下述方法实现：

以嫩茎为外植体的滇杨组织培养方法，包括以下步骤：

（1）取生长健壮、无病虫害的3年生滇杨枝条，摘除枝条上叶片，置于室温下水培一个月，待其长出嫩茎后剪下作为外植体；

（2）将步骤（1）嫩茎置入烧杯中，加入2%次氯酸钠，振荡6min，无菌水冲洗3遍，再加70%酒精消毒40s，之后加0.1%HgCl₂消毒7 min，最后用无菌水冲洗5遍； 

（3）用MS+6BA0.5mg/L+NAA0.05mg/L作为滇杨嫩茎不定芽诱导的分化培养基，将步骤（2）消毒后的无菌嫩茎平放入该培养基，20～25天生长出愈伤组织，约30天在愈伤上长出丛生不定芽；